Herstellung eines mikrofluidischen Vorrichtung für die Abschottung der Neuron Soma und Axonen

Willkommen im Labor von Dr. Newly John. Das John-Labor ist auf die Entwicklung mikrofluidischer Plattformen für biologische Anwendungen spezialisiert. In diesem Video demonstrieren wir die Herstellung und Anwendung eines mikrofluidischen Geräts, das zur Kompartimentierung und Kultivierung von primären Neuronen konzipiert ist.

Die Neuronenvorrichtung wurde erstmals im August 2005 in Nature Methods veröffentlicht. Seit ihrer Einführung wurde die Neuronenvorrichtung weltweit von zahlreichen Kooperationspartnern umfassend genutzt. Die Neuronenvorrichtung besteht aus einem Stück PDMS, das auf einem Siliziumwafer abgegossen wurde, der ein mittels Photolithographie zuvor erzeugtes SUA-Muster der Vorrichtung enthält.

Die Vorrichtung weist drei Hauptmerkmale auf: vier Reservoire mit einem Durchmesser von acht Millimetern, zwei Hauptkanäle, die jeweils 1,5 Millimeter breit, sieben Millimeter lang und hundert Mikrometer hoch sind, sowie Mikrorillen, die 10 Mikrometer breit und drei Mikrometer hoch sind und die beiden Hauptkanäle verbinden. Die Mikrorillen können in ihrer Länge zwischen 150 Mikrometern und 900 Mikrometern variieren, wobei die übliche Standardlänge 450 Mikrometer beträgt. Betrachtet man die Vorrichtung so, dass die Hauptkanäle und die Mikrorillen vertikal ausgerichtet sind, erkennt man, dass die Reservoire auf der linken Seite der Rillen über die Hauptkanäle miteinander verbunden sind, ebenso wie die Reservoire auf der rechten Seite.

Dank dieser Eigenschaft kann Flüssigkeit durch den Hauptkanal fließen, was eine wichtige Funktion darstellt und das Beladen von Zellen sowie das Wechseln des Kulturmediums ermöglicht. Die Neuronenvorrichtung weist drei wesentliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Zellkultursystemen auf. Erstens ermöglicht sie die kompartimentale Trennung von Zellkörpern oder Soma und den Axonen. Mit der Neuronenvorrichtung ist es möglich, reine axonale Fraktionen zu gewinnen.

Die Größe und Länge der Mikrorillen ermöglichen es, dass Axone durch den anderen Hauptkanal hindurchtreten, während gleichzeitig verhindert wird, dass die Soma-Seiten übertreten. Zweitens lässt sich aufgrund des Gerätedesigns und der Nutzung des hydrostatischen Drucks entweder die Zellseite und/oder die Axonseite des Geräts getrennt behandeln, indem einfach das Volumen und die Reservoire auf einer Seite des Geräts höher gehalten werden als auf der anderen. Und drittens kann der rein axonale Anteil des Geräts durch Vakuumabsaugung abgetrennt werden, wodurch der Forscher die axonale Regeneration untersuchen und beobachten kann.

Die Forscherin Hina Lee wird nun die Vorbereitung des mikrofluidischen Neuronengeräts demonstrieren. Ein drei Zoll großer Siliziumwafer mit einem durch Fotolithografie erzeugten Muster aus SU-8 dient zum Gießen der polydimethylsiloxanbasierten (PDMS) mikrofluidischen Form. Wir bezeichnen den mit SU-8 strukturierten Siliziumwafer als Urformen oder einfach als Master.

PDMS wird mit dem Härter im Gewichtsverhältnis von 10 zu 1 gemischt. Das bedeutet beispielsweise 15 Gramm PDMS pro 1,5 Gramm Härter. Anschließend wird das PDMS gründlich vermischt und auf den Siliziumwafer gegossen.

Der Siliziumwafer befindet sich in einer 10 cm großen Polystyrol-Petrischale. Um die MA mit einer Dicke von etwa vier Millimetern zu bedecken, werden ungefähr 12 bis 15 Gramm PDMS benötigt. Das Master mit dem PDMS wird dann in einen Vakuumexsikkator gestellt, wobei der Deckel der Petrischale abgenommen wird, und Vakuum angelegt.

Dies dient dazu, Luftblasen aus dem PDMS zu entfernen, die während des Mischens des Härtemittels eingeführt wurden. Es dauert etwa 15 Minuten, bis die Luftblasen entfernt sind. Der Abgusskörper mit PDMS wird nach 15 Minuten aus dem Vakuum-Exsikkator entnommen.

Es befinden sich noch einige verbleibende Blasen auf dem PDMS-Abformkörper. Eine Druckluftpistole mit einem 0,45-Mikron-Filter wird verwendet, um eventuell verbliebene Blasen zu entfernen. Anschließend wird der Abformkörper zur Aushärtung eine Stunde lang auf eine 80 Grad heiße Heizplatte gestellt.

Wenn kein Vakuum-Exsikkator verfügbar ist, kann das Gemisch mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen werden. Die Luftblasen lösen sich schließlich von selbst auf. Wenn kein Heizblock verfügbar ist, härtet das PDMS nach 24 Stunden bei Raumtemperatur aus.

Es ist wichtig sicherzustellen, dass der Master während des Aushärtungsprozesses waagerecht steht. Sobald das PDMS auf dem Master ausgehärtet ist, wird es mit einer chirurgischen Klinge in eine saubere Haube gebracht. Ein kreisförmiger Schnitt entlang des Umfangs der Vorrichtungen wird angebracht.

Es ist wichtig, dass man die Klinge in das PDMS einführt, um Kontakt mit dem Siliziumwafer herzustellen, aber nicht zu stark auf den Wafer drückt, da sonst der Master mit einem kreisförmigen Schnitt rund um die Bauelemente bricht. Es befinden sich vier Bauelemente auf jedem dreizölligen Silizium-Master. Das PDMS wird vorsichtig vom Master abgehoben.

Dies kann durch vorsichtiges Drehen der chirurgischen Klinge eingeleitet werden, während sie in den vorherigen Schnitt eingeführt wird. Bei den PDMS-Vorrichtungen auf der Form ist dies sehr dünn. Nach oben gerichtete Reservoire werden mit einer 8-mm-Gewebebiopsiepunch in das Gerät eingestanzt.

Der im Stanzer verbleibende Abfall wird mit einer Stange herausgedrückt. Anschließend werden die Geräte in Viertel zerlegt und überschüssiges PDMS abgeschnitten, damit das Gerät passgenau auf eine Corning-Abdeckung passt. Ein Deckglas Nummer eins der Größe 24 Millimeter mal 40 Millimeter wird mit Druckluft verwendet, um jeglichen überschüssigen Abfall zu entfernen.

Störrischer Schmutz kann ebenfalls mit 3M Scotch Brand 4 7 1 Vinylband entfernt werden. Die gereinigten Vorrichtungen sind nun bereit für die Plasmaverbindung. Ein Herrick-Plasmareiniger wird verwendet, um die Neuronenvorrichtungen kurzzeitig mit den Deckgläsern zu verbinden.

Die Geräte und die Deckgläser werden auf ein Tablett gestellt, und das Tablett wird anschließend in den Plasmareiniger gegeben, wobei eine Vakuumpumpe verwendet wird, um die Luft aus der Kammer zu evakuieren. Es ist wichtig zu beachten, dass die PDMS-Geräte mit der Oberseite nach oben platziert werden, das heißt, das Design zeigt nach oben, damit es dem Plasmagas ausgesetzt ist.

Nachdem der Vakuumdruck 300 Millitorr erreicht hat, wird die Stromzufuhr zur elektrischen Spule eingeschaltet und auf hoch gestellt. Die Tür wird leicht geöffnet, um etwas Luft in die Kammer gelangen zu lassen, was zur Erzeugung des Plasmas beiträgt. Die Vorrichtungen und das Abdeckglas werden zwei Minuten lang einer Plasma-Behandlung unterzogen.

Beachten Sie die violette Farbe in der Kammer. Das ist das eigentliche Plasma. Die elektrische Spule erzeugt ein Plasma, das ein teilweise ionisiertes Gas aus Elektronen, Ionen und neutralen Atomen oder Molekülen ist.

Das Plasma erzeugt reaktive Spezies auf der Oberfläche des Glases und des Geräts, die zusammen eine dauerhafte Bindung eingehen. Das Plasma macht die Oberfläche außerdem hydrophil, was die Zugabe von Flüssigkeiten erleichtert. Der Plasma-Reiniger sterilisiert die Geräte ebenfalls.

Nach der Plasmabehandlung für zwei Minuten wird die Leistung im Vakuum abgeschaltet und Luft in die Kammer geleitet. Die plasmabehandelten Oberflächen des Glases und der mikrofluidischen Vorrichtung werden in einem Reinraumtisch in Kontakt miteinander zusammengefügt. Die Vorrichtungen werden anschließend in sterile 60-Millimeter-Dishs gegeben.

Die plasmabehandelten Oberflächen des Glases und des Geräts bilden eine feste, irreversible Bindung. Innerhalb von 10 Minuten nach der Plasma-Bindung wird dem Gerät Polyol-Lysin zugesetzt. Nach 10 Minuten nimmt die Hydrophilie des Geräts ab.

dadurch erschwert sich das Eindringen des PLL in das Gerät. Nach dem Hinzufügen von PLL ist es wichtig, das Gerät auf Luftblasen zu überprüfen. Eine einfache Methode, vorhandene Luftblasen zu entfernen, besteht darin, eine P-200-Pipette zu verwenden, die mit 100 Mikrolitern Flüssigkeit gefüllt ist.

In diesem Fall platziert man PLL die Pipettenspitze direkt am Eingang des Hauptkanals und drückt dann den P 200 kräftig nach unten. Dieser Vorgang muss möglicherweise mehrmals wiederholt werden, aber schließlich treibt die Kraft der Pipette die Bläschen heraus. Die Geräte, die PLL enthalten, werden über Nacht in einem standardmäßigen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad mit 5 % CO2 inkubiert.

Nach 24-stündiger Inkubation mit PLL werden die Geräte zweimal kurz mit autoklaviertem deionisiertem Wasser gespült. Dabei wird die Flüssigkeit niemals vollständig aus den Hauptkanälen, sondern nur aus den Reservoirs entfernt. Das Entfernen der Flüssigkeit aus den Hauptkanälen würde Blasen einführen.

Nach zwei kurzen Spülgängen werden die Geräte erneut mit autoklaviertem deionisiertem Wasser gefüllt und für mindestens drei Stunden oder über Nacht zurück in den Inkubator gestellt. Am nächsten Tag, nachdem die Geräte über Nacht oder mindestens drei Stunden mit Wasser inkubiert wurden, werden sie erneut in die Biosicherheitswerkbank gebracht und zweimal mit deionisiertem Wasser gespült. Anschließend wird neuronales Basalmedium, das die notwendigen Zusätze B 27 und Glutamat für die Kultivierung primärer Rattenneuronen enthält, zu den Geräten hinzugefügt.

Die Geräte werden anschließend wieder in den Inkubator zurückgestellt, um sie später zu verwenden. Die Geräte sind nun bereit, um Neuronen aufzunehmen. In diesem Video haben wir die Technik der weichen Lithografie demonstriert, die wir zur Herstellung unserer Neuronengeräte verwenden.

Mit diesen Geräten können Neuronen und andere relevante Zelltypen kultiviert werden. Der Hauptvorteil dieser Geräte liegt in der Möglichkeit, die Kultivierung der neuronalen Zellkörper auf der einen Seite des Geräts von einem reinen axonalen Anteil auf der anderen Seite räumlich zu trennen und zu kompartimentieren. Im nächsten Video zeigen wir Ihnen, wie wir kortikale Neuronen aus E18-fötalem Rattenhirn vorbereiten und wie wir die Zellen in das Gerät einbringen.

Das war's also aus dem John-Labor. Vielen Dank fürs Zuschauen.