Vorbereitung E18 Kortikale Rattenneuronen für Kompartimentierung in einer mikrofluidischen Vorrichtung

Hallo und willkommen im Labor von Dr. Newly John. In einem vorherigen Video haben wir gezeigt, wie wir das Neuronen-Gerät herstellen, eine Plattform, die es dem Forscher ermöglicht, die Zellkörper der Neuronen von einer reinen axonalen Fraktion zu trennen. Die weiche Lithographie ist die verwendete Technik zur Herstellung der Geräte, die darin besteht, PDMS auf einen Siliziumwafer zu gießen und zu aushärten, der das zuvor mittels Fotolithographie hergestellte Gerätedesign enthält.

In diesem Video demonstrieren wir die Herstellung von primären kortikalen Rattenneuronen vom Typ spro dolly E 18 und die Beladung der Neuronen in die Neuronenvorrichtung. Ich möchte Ihnen Kiana Lee vorstellen. Sie wird heute die Demonstrationen durchführen.

Bevor Sie beginnen, ist es wichtig, dass alle erforderlichen Medien und Reagenzien im Wasserbad auf 37 Grad erwärmt sind. Sie sehen hier Neurobasal-Medium, 0,25 % Trypsin und DMEM, das 10 % FBS enthält. Es ist entscheidend sicherzustellen, dass alles, was in den Sterilwerkbank zur Reparatur der Zellen gebracht wird, sterilisiert und mit 70 % Ethanol abgewischt wurde.

Zunächst wird die Gewebekulturhaube mit 70 % Ethanol abgewischt. Danach werden die Kunststoffgestelle zum Halten der Röhrchen mit Ethanol besprüht. Anschließend wird der beim Tri-Streichverfahren verwendete Gummiball mit Ethanol gereinigt.

Es ist wichtig, dies frühzeitig durchzuführen, damit es ausreichend Zeit zum Trocknen hat. Anschließend werden die erforderlichen Reagenzien mit Ethanol abgewischt und in die Abzugshaube gebracht. Zwei Stücke des E18-fetalen Rattenkortex, die ein zuvor präpariertes Gehirn repräsentieren, werden in ein 15-ml-Röhrchen gegeben, das ein ml eiskaltes, calciumfreies, magnesiumfreies Dissektionspuffer enthält. Ein ml 0,25 %igem Trypsin-EDTA wird dem Kortex im Dissektionspuffer hinzugefügt, wodurch das Endvolumen zwei ml und die endgültige Trypsinkonzentration 0,125 % beträgt. Das 15-ml-Röhrchen mit dem Kortex und dem nun zugegebenen Trypsin wird dann für acht Minuten in ein 37-Grad-Wasserbad gestellt, während der fetale Kortex bei 37 Grad im Trypsin inkubiert wird.

Drei Pasteurpipetten werden an der Flamme geglättet. Die Spitze der Glaspipette wird leicht in die Nähe des blauen Teils der Flamme gebracht und langsam gedreht, bis sich lediglich die Öffnung orange verfärbt. Während sie orange wird.

Es ist wichtig, die Glaspipette weiterzudrehen, damit sie nicht kollabiert. Beachten Sie, dass die Öffnungen der Glaspipetten sukzessive kleiner werden. Es ist außerdem wichtig zu beachten, dass die Öffnungen nicht zu klein gemacht werden sollten, da dies eine Lyse der Zellen verursachen kann, nachdem der Kortex acht Minuten bei 37 °C mit Trypsin inkubiert wurde; anschließend werden 10 ml DMEM, die 10 % FBS enthalten, dem Kortex zugegeben, um die Trypsinreaktion zu stoppen.

Das 15-ml-Röhrchen, das den Kortex und DMEM mit 10 % FBS enthält, wird bei 2.500 U/min für zwei Minuten zentrifugiert. Im Biosicherheitswerkbank wird mittels Vakuumsaugung, die an eine Glaspipette angeschlossen ist, der Überstand vom Kortex entfernt. Dabei ist darauf zu achten, das Pellet nicht zu stören oder zu lösen.

1 ml neuronales Basalmedium, das B 27 und Glutamat enthält, wird zum Cortexpräzipitat gegeben und vorsichtig auf- und abpipettiert. Es ist sehr wichtig, beim Auf- und Abpipettieren keine Luftblasen zu erzeugen, da diese die Zellen durch Oxidation schädigen können. Anschließend wird die fein geschliffene hintere Pipette mit der größten Öffnung verwendet, um den Cortex zu tritieren, indem eine sterile Gummibürste an das Ende der Pipette angebracht und etwa fünfmal auf- und abpipettiert wird.

Dabei darauf achten, keine Luftblasen einzuführen. Gut. Der Prozess wird mit den beiden anderen Glaspipetten, jeweils mit verkleinerter Öffnungsgröße, fortgesetzt. Wie bereits erwähnt, ist es wichtig sicherzustellen, dass während des Dreifach-Streichprozesses keine Blasen entstehen.

Sie sollten außerdem bemerken, dass Sie keine sichtbaren Stücke mehr sehen. Es ist wichtig, weiterzurühren, bis keine Stücke des Kortex mehr im Medium sichtbar sind. Nach der Inkubation werden die Zellen erneut bei 2.500 U/min für zwei Minuten zentrifugiert.

Dies entspricht in etwa der Größe des Pellets, das man von zwei Stückchen Kortex erwarten würde. Nach der Zentrifugation wird das Überstand erneut vom Zellpellet abgenommen. Nachdem der Überstand entfernt ist, wird ein Milliliter Neurobasal-Medium, das B27 und Glutamat enthält, zum Kortex gegeben und zum erneuten Aufschwemmen des Kortex verwendet.

Das Zellpellet wird erneut vorsichtig mehrmals auf- und abpipettiert, um das Entstehen von Blasen zu vermeiden und sicherzustellen, dass das Zellpellet gleichmäßig verteilt und vollständig aufgelöst ist. Ein weiterer Milliliter Neurobasal-Medium wird der Zellsuspension zugegeben, wodurch das Endvolumen zwei Milliliter beträgt. Anschließend wird die resuspendierte Zelllösung durch einen 40-Mikrometer-Zellsieb von BD Biosciences filtriert, um danach die Zellen zu zählen und ihre Vitalität zu beurteilen.

60 µL frisches neuronales Basalmedium werden in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Anschließend werden 20 µL Zellen zu den 60 µL neurobasalem Medium hinzugefügt und schließlich 20 µL Trypanblau zu den Zellen im neurobasalen Medium zugegeben. Das Trypanblau färbt die Zellen an, die nach der Färbung mit Trypanblau nicht mehr lebend sind.

Wir pipettieren 20 µL auf ein Hämozytometer und betrachten sie unter dem Mikroskop. Lebende Zellen erscheinen klar und durchscheinend, während Zellen mit beschädigten Membranen aufgrund des Trypanblau blau angefärbt sind. Typischerweise erhalten wir etwa 2,5 Millionen Zellen und 8 Millionen Zellen pro Kortex.

Normalerweise erhalten wir zwei Stücke des Cortex von einem Gehirn, wobei die Zellen in einem Endvolumen von zwei Milliliter resuspendiert sind. Die endgültige Zellkonzentration liegt somit typischerweise zwischen 2,5 Millionen Zellen pro Milliliter und 8 Millionen Zellen pro Milliliter. Üblicherweise geben wir etwa 20 Mikroliter Zellen pro Gerät auf.

Dies ergibt eine Zellzahl pro Gerät zwischen 50.000 Zellen und 160.000 Zellen. Die Zelldichten können je nach Anwendung variiert werden. Allerdings führt das Ansäen primärer Neuronen in zu geringer Dichte in der Regel zum Zelltod. Geräte, die zuvor mit neuronalem Basalmedium vorbereitet wurden, werden zur Wahrung der Sterilität in den Biosicherheitswerkbank gebracht.

Überschüssiges Medium aus den Vertiefungen wird durch eine Vakuumabsaugung entfernt. Dabei muss jedoch darauf geachtet werden, nicht das gesamte Medium zu entfernen. Es muss etwas Medium im Hauptkanal verbleiben; nur das Medium aus den Reservoirs sollte abgesaugt werden.

Nur 20 Mikroliter Zellen werden auf das obere linke Reservoir des Geräts aufgebracht. Die Zellen strömen in das Gerät hinein und heften sich an der mit PLL behandelten Oberfläche an. Hier sehen Sie die Zellen, während sie durch den Hauptkanal fließen, und Sie werden bemerken, dass einige von ihnen sich tatsächlich an dem Glas festsetzen.

Nach dem Beladen werden die Geräte mit den Zellen für etwa 10 Minuten in einen Inkubator zurückgestellt, damit sich die Zellen anheften können. Nach 10 Minuten im Inkubator werden die Geräte erneut in die Sicherheitswerkbank gebracht, die Reservoirs mit Medium gefüllt und anschließend werden die Geräte wieder in den Inkubator zurückgestellt. Einige wichtige Hinweise: Abhängig vom Inkubator und dem erforderlichen Feuchtigkeitsniveau des Mediums, muss dieses in den Geräten alle zwei bis drei Tage gewechselt werden.

Es ist empfehlenswert, frisches Medium in die oberen Brunnen zu geben und etwas frisches Medium durch das Gerät und in die Hauptkanäle fließen zu lassen, bevor alle Reservoire gefüllt werden. Die Neuronen werden hier mit Calcium, einem zellpermeablen Farbstoff, der lebende Zellen anfärbt, sichtbar gemacht. Hier sehen Sie die somatische oder Zellseite des Geräts, die die Zellkörper, Axone und Dendriten enthält.

Während wir über das Gerät schwenken, können Sie die mikroskopischen Rillen sehen, durch die die Axone wachsen, um die andere Seite des Geräts zu erreichen, die Axon-Seite, die einen reinen axonalen Anteil enthält. Zu Demonstrationszwecken werden diese fluoreszenzmarkierten Zellen verwendet, um das Axotomie-Verfahren zu veranschaulichen.

Eine der Eigenschaften des Neuronengeräts besteht darin, dass es dem Forscher ermöglicht, eine Exotomie durchzuführen, bei der die Axone aus dem reinen axonalen Anteil des Geräts durchtrennt werden, um beispielsweise Untersuchungen zur axonalen Regeneration durchzuführen. Keano wird nun die Durchführung einer Exotomie im Neuronengerät demonstrieren; die Exotomie erfolgt mittels Vakuum.

Ein steriler Glaspipettierer wird an der unteren Öffnung des Wells auf der axonalen Seite platziert, das Medium wird unter Vakuum abgesaugt. Das gesamte Medium wird von der axonalen Seite des Geräts entfernt, einschließlich des Mediums im Hauptkanal. Um den Vorgang nach dem Entfernen des Mediums zu wiederholen, werden 150 Mikroliter Medium in den Hauptkanal gedrückt, indem die Pipettenspitze an der Öffnung des Hauptkanals angebracht und die Pipette mit Druck betätigt wird.

Anschließend wird Vakuum an die Öffnung des Hauptkanals und des oberen Wells der axonalen Seite des Geräts angelegt. Erneut wird Vakuum verwendet, um das gesamte Medium von der axonalen Seite einschließlich des Hauptkanals zu entfernen. Danach werden erneut 150 Mikroliter Medium in den Hauptkanal gedrückt, indem die Pipettenspitze an die Öffnung des Hauptkanals gehalten und die Pipette mit Kraft betätigt wird.

An diesem Punkt kann der Forscher das Gerät unter dem Mikroskop untersuchen, um die Effizienz des Axonschnitts zu überprüfen. Falls die Axone nicht ausreichend durchtrennt wurden, kann der Vorgang bei Bedarf wiederholt werden. In diesem Video haben wir Ihnen gezeigt, wie man E18-fetale kortikale Neuronen präpariert und in das Neuronen-Gerät einläd.

Der Hauptvorteil dieser Vorrichtungen liegt in der Möglichkeit, die Kultivierung der neuronalen Zellkörper auf der einen Seite der Vorrichtung von einem reinen axonalen Anteil auf der anderen Seite zu trennen und räumlich zu isolieren. Wir hoffen, dass dieses Video für Sie informativ und hilfreich war. Damit schließen wir aus dem John-Labor.

Vielen Dank fürs Zuschauen.