Passagierung humaner neuraler Stammzellen

Hallo, ich bin Steve. Ich arbeite im Labor von Dr. Flanagan in der Abteilung für Pathologie an der UC Irvine. Heute zeige ich Ihnen, wie man humane neuronale Vorläuferzellen aufspaltet.

Diese Technik beinhaltet das Beschichten eines neuen Kolbens mit einer Lösung aus humanem Fibronectin, das Ablösen der Zellen mit einem Zelldissoziationspuffer, anschließendes Neutralisieren des Zelldissoziationspuffers mit einer 10 %igen Serumlösung, Zentrifugation der Zellsuspension und Wiederaufschlämmen der Zellen in frischem Medium sowie das Überführen der Zellsuspension in einen neuen Kolben. In unserem Labor kultivieren wir humane neuronale Vorläuferzellen, indem wir alle zwei Tage die Hälfte des Kulturmediums wechseln, und wir passagieren sie etwa einmal pro Woche im Verhältnis von eins zu zwei. Wenn ich Zellen passagiere, zähle ich sie gegebenenfalls, wenn ich sie für ein Immunchemie-Experiment benötige oder wenn ich eine Transfektion mit einem nukleären Effektor durchführen möchte.

Es ist wichtig, einen Zelldissoziationspuffer bei der Verpackung von Zellen zu verwenden, da dieser im Gegensatz zu Trypsin nicht enzymatisch wirkt und viel schonender für die Zellen ist. Hallo, wir befinden uns jetzt im Zellkulturraum. Bevor ich Ihnen zeige, wie ein konfluenter Kolben mit menschlichen Vorläuferzellen aussieht, werde ich zuerst die Zellkultur vorbereiten. Zunächst schalte ich das UV-Licht aus und schalte die Beleuchtung sowie die Luftzirkulation ein.

Danach werde ich die Haube mit 70 % Ethanol desinfizieren, indem ich ein Papiertuch besprühe und die Haube damit abwische. Es ist wichtig, das Papiertuch mit 70 % Ethanol zu besprühen und nicht direkt die Innenseite der Haube, da das Besprühen der Haube mit 70 % Ethanol den HEPA-Filter beschädigen könnte, der sehr teuer ist. Danach werde ich alle Reagenzien und Geräte besprühen.

Und schließlich werde ich die Vakuumschläuche besprühen, und dann sind wir fertig. Werfen wir einen Blick auf diese Zellen. Diese Zellen sehen etwa 80 % konfluent aus.

Dies sind humane neuronale Vorläuferzellen, die aus menschlichen Feten isoliert wurden, und wir kultivieren sie in T-25-Flaschen. Wir teilen sie etwa einmal pro Woche, im Verhältnis von eins zu zwei. Ich bin jetzt bereit, meine Zellen zu passagieren.

Als Erstes nehme ich nun einen neuen T-25-Kolben, den ich vier Stunden lang mit humanem Fibronectin von BD Biosciences beschichtet habe. Ich habe die Fibronectin-Lösung bereits entfernt und werde den Kolben vor dem Umsetzen der Zellen mit BBS spülen.

Und jetzt hole ich die Zellen aus dem 37-Grad-Inkubator. Da sind sie. Nun werde ich die PBS-Waschlösung aus dem neuen Kolben entfernen, der mit humanem Fibronectin beschichtet wurde.

Und ich werde zwei Milliliter altes konditioniertes Medium in den neuen Kolben geben. Jetzt muss ich meine Zellen mit PBS spülen, bevor ich sie von der Oberfläche lösen kann. Zuerst werde ich das verbleibende Medium entfernen und anschließend etwa zwei Milliliter PBS hinzufügen, ohne die Zellen austrocknen zu lassen.

Ich werde etwa zwei Minuten warten, bevor ich PBS entferne und den Dissoziationspuffer hinzugebe, um die Zellen von der Oberfläche des Kolbens zu lösen. Jetzt entferne ich das PBS und werde erneut versuchen, sofort den Zelldissoziationspuffer hinzuzufügen, damit die Zellen nicht austrocknen. Daher werde ich 1,5 mL Zelldissoziationspuffer hinzugeben.

Und im Gegensatz zu PBS werde ich es direkt auf die Zellen geben und versuchen, so viel Oberfläche wie möglich zu bedecken. Daher bewege ich den Kolben von Seite zu Seite, während ich diesen Puffer langsam auf die Zellen auftrage. Nun werde ich etwa fünf Minuten warten, bis die Zellen beginnen, sich von der Oberfläche zu lösen.

Und ich werde den Kolben bei Raumtemperatur im Abzug stehen lassen. Wie Sie hier sehen können, runden sich die Zellen zunächst ein und lösen sich dann von der Oberfläche ab, sodass bereits einige Zellen im Schwebestadium sichtbar sind. Wenn Sie kräftig von der Seite gegen den Kolben klopfen, hilft das, sie abzulösen.

Es sind nun also fünf Minuten vergangen, und wie Sie sehen können, ist die Lösung stark mit Zellen angereichert, die von der Oberfläche abgelöst wurden. Nun werde ich die Wirkung des Zell-Dissociationspuffers neutralisieren, indem ich 4,5 ml Medium mit Serum hinzugebe. Ich werde 10 % hitzeinaktiviertes fetalen Kälberserum in D-M-E-M-F-12-Medium verwenden und es direkt auf die Oberfläche des Kolbens geben, um sicherzustellen, dass keine Zellen mehr angeheftet bleiben.

Ich werde nun vorsichtig auf- und abpipettieren, um eventuell noch verbliebene Zellen zu lösen. Anschließend werde ich die Zelllösung in ein 15-ml-Konischgefäß überführen und eine Minute lang mit tausend U/min zentrifugieren.

Die Zellen sind fertig zentrifugiert und wir haben hier ein schönes Zellpellet. Ich werde das Serummedium sehr, sehr vorsichtig entfernen, ohne das Pellet zu stören. Anschließend werde ich das Pellet in vier Milliliter des Mediums resuspendieren.

Ich werde versuchen, das Pellet so aufzususpenderen, dass keine Zellklumpen mehr vorhanden sind und die Lösung homogen wird, also keine Klumpen enthält. Da ich eine Teilung im Verhältnis 1:2 durchführe, nehme ich zwei der vier Milliliter und übertrage sie in den neuen Kolben, der bereits zwei ml konditioniertes Medium enthält. Abschließend beschrifte ich den Kolben mit dem Zelltyp, der Passagezahl und dem Datum.

Das ist ein Blick auf die Zellen, die wir vor einer halben Stunde passagiert haben. Wie Sie sehen können, haben sich die meisten von ihnen an der Oberfläche angeheftet und beginnen bereits, Fortsätze auszubilden. Das war's, Leute.

Und jetzt bin ich bereit zu zählen.