iClip - Transkriptom-weiten Mapping von Protein-RNA Wechselwirkungen mit Individual Nucleotide Resolution

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine transkriptomweite Karte der Bindungsstellen eines RNA-Bindungsproteins mit einzelner Nukleotidauflösung zu erhalten. Dazu wird als zweiter Schritt eine UV-Bestrahlung lebender Zellen durchgeführt, um Proteine und RNA in vivo kovalent zu vernetzen. Das RNA-Bindungsprotein wird unter strengen Bedingungen immunpräzipitiert, um die vernetzten RNA-Fragmente anzureichern.

Die anschließende Reverse Transkription erzeugt cDNAs, die häufig an dem angebundenen Peptid abgeschnitten werden, wodurch die Information über die Vernetzungsposition innerhalb der RNA erhalten bleibt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen alle Bindungsstellen innerhalb des Transkriptoms, basierend auf der Hochdurchsatzsequenzierung der cDNA-Bibliothek. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der RNA-Biologie zu beantworten, beispielsweise wie das Zusammenspiel verschiedener RNA-bindender Proteine die RNA-Prozessierung reguliert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir sowohl die Leistungsfähigkeit als auch die Auflösung unserer transkriptomweiten Karten der Protein-RNA-Interaktionen erhöhen. Um mit dem Verfahren der UV-Vernetzung von Zellkulturzellen zu beginnen.

Entfernen Sie das Medium von einer 10 cm großen Platte mit Healer-Zellen. Geben Sie sechs Milliliter eiskalte PBS hinzu und stellen Sie die Platten auf Eis. Eine Platte reicht für drei Experimente aus.

Entfernen Sie den Deckel und bestrahlen Sie die Zellen, einmal mit 254 Nanometern bei 150 Millijoule pro Quadratzentimeter. Sammeln Sie die Zellen, indem Sie sie mit einem Zellabstreifer von den Platten abkratzen, und überführen Sie zwei Milliliter Zellsuspension in jeweils drei Mikroröhrchen, um die Zellen zu pelletieren. Zentrifugieren Sie sie für 10 Sekunden bei maximaler Drehzahl bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie dann die Supinatschnappe, gefrieren Sie die Zellpellets auf Trockeneis ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius bis zur Verwendung. Geben Sie 100 Mikroliter Protein A Dynabeads pro Experiment in ein frisches Mikroröhrchen. Wenn Sie mit Maus- oder Ziegenantikörpern arbeiten, verwenden Sie Protein G Dynabeads.

Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit Lysepuffer, der im beigefügten schriftlichen Protokoll zu finden ist. Resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern Lysepuffer mit zwei bis 10 Mikrogramm Antikörper. Drehen Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur 30 bis 60 Minuten lang.

Waschen Sie die Kügelchen anschließend dreimal mit 900 Mikrolitern Lysepuffer und lassen Sie sie im letzten Waschschritt zurück, bis Sie fortfahren möchten. Führen Sie die Immunpräzipitation von Thor-Zellkomplexen auf Eis durch. Resuspendieren Sie in einem Milliliter Lysepuffer und überführen Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen.

Stellen Sie eine Verdünnung von RNA eins im Verhältnis 1:500 her. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter zusammen mit zwei Mikrolitern Turbo-DNase zum Zelllysat. Inkubieren Sie die Proben genau drei Minuten bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 1.100 Umdrehungen pro Minute und stellen Sie sie anschließend sofort auf Eis.

Danach die Proben bei vier Grad Celsius und 22.000 × g für 20 Minuten zentrifugieren, um das Lysat zu klären; sammeln Sie vorsichtig das Überstand, wobei etwa 50 Mikroliter Lysat mit dem Pellet verbleiben, um die Perlen immunpräzipitativ zu behandeln. Entfernen Sie den Waschpuffer und geben Sie dann die vorbereiteten Zelllysate hinzu. Inkubieren Sie die Proben unter Schwenken zwei Stunden bei vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie das SUP-Reagenz und waschen Sie die Kügelchen zweimal mit 900 Mikrolitern Puffer mit hohem Salzgehalt, der in der beigefügten schriftlichen Anleitung zu finden ist. Waschen Sie die Kügelchen abschließend zweimal mit 900 Mikrolitern Waschpuffer. Fahren Sie dann mit der Dephosphorylierung fort und fügen Sie einen Linker an die drei-prim-Enden der RNA hinzu.

Um die RNA an den 5'-Enden zu markieren, hinter einem Plexiglasschild arbeiten. Die Überstände der letzten Waschung der Linkerligationsreaktion entfernen und die Pellets in acht Mikrolitern heißer PNK-Mischung resuspendieren. Fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Entfernen Sie die heiße PNK-Mischung und wiederverwenden Sie sie. Suspendieren Sie die Kügelchen in 20 Mikrolitern eines frischen 1× PAGE-Ladepuffers. Inkubieren Sie anschließend die Probe 10 Minuten lang bei 70 Grad Celsius in einem Thermomischer.

Stellen Sie die Probe sofort auf einen Magneten, um die leeren Perlen auszufällen. Laden Sie die Proben auf ein 4–12%-New-Page-Bis-Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers auf.

Außerdem fünf Mikroliter eines vorgefärbten Protein-Größenmarkers laden. Das Gel 50 Minuten lang bei 180 Volt laufen lassen. Die Protein-RNA-Komplexe mithilfe der NOVA-Blottingvorrichtung für Nassübertragung gemäß den Herstelleranweisungen vom Gel auf eine Nitrocellulosemembran übertragen.

Nach der Übertragung die Membran in PBS-Puffer spülen. Anschließend in Frischhaltefolie einwickeln und bei minus 80 Grad Celsius dem Film aussetzen. Belichtungen für 30 Minuten, eine Stunde und über Nacht durchführen.

Als Nächstes isolieren Sie den Membranbereich entsprechend den Protein-RNA-Komplexen von den niedrigmolekularen RNAs. Führen Sie das Experiment unter Verwendung des Autoradiogramms als Maske durch. Gewinnen Sie die RNA aus der Membran durch Proteinase-K-Digestion und Phenol-Chloroform-Extraktion zurück.

Transkribieren Sie die RNA mit einem der AYP-Primer, um die CDNA per Gelelektrophorese zu reinigen. Mischen Sie sechs Mikroliter der CDNA-Probe mit sechs Mikrolitern zweifach konzentrierter TBE-Harnstoff-Laufpufferlösung. Direkt vor dem Auftragen der Proben auf ein Gel.

Erhitzen Sie die Proben auf 80 Grad Celsius für drei Minuten. Anschließend laden Sie die Proben zusammen mit einem Marker für niedriges Molekulargewicht auf ein vorgefertigtes 6 % TBE-Harnstoffgel auf. Lassen Sie das Gel 40 Minuten lang bei 180 Volt laufen, wie vom Hersteller beschrieben, und verwenden Sie den oberen Farbstoff und die Markierungen am Kunststoffgelträger als Orientierungshilfe für die Ausschneidung.

Schneiden Sie drei Banden bei 120 bis 200 Nukleotiden, 85 bis 120 Nukleotiden und 70 bis 85 Nukleotiden aus. Beachten Sie, dass der Arc-Lip-Primer und die L3-Sequenz zusammen 52 Nukleotide der CLIP-Sequenz ausmachen. Geben Sie 400 µL TE hinzu und zerkleinern Sie den Gelstück in kleine Stücke.

Unter Schütteln mit 1.100 Umdrehungen pro Minute für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius die Gelecken mit einem Eins-Milliliter-Spritzenstößel inkubieren. Zwei ein Zentimeter große Glas-Vorfilter in eine CoStar Spinx-Säule geben. Den flüssigen Anteil der Probe in die Säule überführen und eine Minute bei 13.000 Umdrehungen pro Minute in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen zentrifugieren.

Fügen Sie 0,5 µL Glyco-Blau und 40 µL Natriumacetat pH 5,5 hinzu. Anschließend mischen Sie die Probe. Geben Sie ein Milliliter 100 %igen Ethanol hinzu.

Mischen Sie erneut und präzipitieren Sie die Probe über Nacht bei minus 20 Grad Celsius. Schließen Sie schließlich die cDNA-Moleküle kreisförmig, um die Adapterregion an das 5'-Ende anzubinden. Danach wieder linearisieren und PCR-amplifizieren gemäß dem beigefügten schriftlichen Protokoll, bevor die Sequenzierung der Eye-Clip-Bibliothek erfolgt. Der Erfolg des Experiments kann in zwei Schritten überwacht werden.

Das Autoradiogramm des Protein-RNA-Komplexes nach Membrantransfer und das Gelelektrophoresebild der PCR-Produkte im Autoradiogramm der RNA-armen Proben zeigen bei RNA-reichen Proben eine diffuse Radioaktivität oberhalb des Molekulargewichts des Proteins. Diese Radioaktivität ist bei RNA-reichen Proben näher am Molekulargewicht des Proteins lokalisiert. Wird bei der Immunpräzipitation kein Antikörper verwendet, sollte kein Signal nachweisbar sein.

Weitere wichtige Kontrollen zur Spezifität der Immunpräzipitation bestehen entweder im Einsatz von UVE-Bestrahlung oder in der Verwendung von Zellen, die das Protein von Interesse nicht exprimieren. Das Gelelektrophoresebild der PCR-Produkte sollte einen Größenbereich zeigen, der der cDNA-Fraktion entspricht. Beachten Sie, dass die PCR-Primer P drei Celexa und P fünf Celexa zusätzliche 76 Nukleotide zur Größe der cDNA hinzufügen. Wenn während der Immunpräzipitation kein Antikörper verwendet wird, sollte kein entsprechendes PCR-Produkt nachweisbar sein.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass jeder der 64 Schritte entscheidend ist und mit hundertprozentiger Genauigkeit durchgeführt werden muss. ICL-Daten können rechnergestützt mit transkriptomweiten Funktionsanalysen integriert werden. Dies kann beispielsweise Einblicke in die positionsabhängige Regulation der RNA-Verarbeitung liefern.

Für die computergestützte Datenanalyse verweisen wir auf unsere jüngsten Publikationen in Zusammenarbeit mit Nicholas KA vom European Bioinformatics Institute und bla zupan von der Universität Liana. Nun ist es an der Zeit, dass Sie mit Ihren eigenen Experimenten beginnen. Viel Spaß.