Studieren Zellrollen Trajectories auf Asymmetric Rezeptor Patterns
13. Februar 2011
Wir beschreiben ein Protokoll zu beobachten und zu analysieren Zellrollen Trajektorien auf asymmetrische Rezeptor-gemusterten Substrate. Die resultierenden Daten sind nützlich für das Engineering von Rezeptor-gemusterten Substrate für Label-freie Zelle Trennung und Analyse.
Dieses Protokoll beobachtet und analysiert Zellwanderungsbewegungen auf asymmetrischen Rezeptormustern, um die Entwicklung von Rezeptormuster-Substraten für die markierungsfreie Zellseparation und -analyse zu unterstützen. Beginnen Sie mit dem Mikrokontaktdruck von PEG-Molekülen auf einem Goldsubstrat, um abwechselnde Muster von selbstassemblierenden Monolagen zu erzeugen, gefolgt von der Auffüllung des Substrats mit P-Selectin und Rezeptoren. Danach wird das Substrat in die Durchflusskammer eingebaut. Leiten Sie die HL-60-Zellen in die Kammer ein.
Nehmen Sie eine Bildsequenz der rollenden Interaktion von HL-60-Zellen auf P-Selektin-Mustern auf und analysieren Sie die aus dem Video konvertierten Bilder. Die Trajektorien der rollenden Zellkante, die Rollgeschwindigkeiten sowie die Weglängen in der Ebene, Region und am Rand können mithilfe eines MATLAB-Programms ermittelt werden. Diese Methode kann Einblicke darüber geben, wie HO-60-Zellen sich auf asymmetrischen Rezeptormustern unter Scherfluss bewegen.
Dies kann zur Quantifizierung anderer zellulärer Oberflächenwechselwirkungen sowie zur direkten Analyse der Zellen durch Beobachtung ihrer Trajektorien auf Rezeptormustern angewendet werden. Außerdem eignet es sich zur Konstruktion mikroskaliger Vorrichtungen zur Zellseparation. Mikrokontaktdruck wird verwendet, um abwechselnde Muster von selbstassemblierten Monolagen aus PEG-Molekülen auf einem Goldsubstrat zu erzeugen.
Befeuchten Sie den PDMS-Stempel zunächst mit einer fünf Millimolar PEG-Lösung in Ethanol. Trocknen Sie die Oberfläche 20 Minuten lang. Legen Sie den Stempel vorsichtig für 40 Sekunden auf die Goldoberfläche und stellen Sie sicher, dass ein guter Kontakt zwischen der Goldoberfläche und dem Stempel besteht.
Es ist kein Überschussdruck erforderlich. Spülen Sie die Oberfläche mit Ethanol und trocknen Sie sie unter einem Strom von Stickstoff. Inkubieren Sie nun mithilfe einer Perfusionskammer die Substrate drei Stunden bei Raumtemperatur mit einer P-Selectin-Lösung von 15 Mikrogramm pro Milliliter, um die verbleibenden Bereiche mit P-Selectin zu mustern. Spülen Sie die Kammer und füllen Sie anschließend die Oberflächen eine Stunde lang mit einer BSA-Lösung von einem Milligramm pro Milliliter auf, um unspezifische Wechselwirkungen zu blockieren.
Spülen Sie die Oberfläche mit DPBS-Puffer, bevor Sie das Zellwälzexperiment durchführen. Bauen Sie die Durchflusskammer zusammen und leiten Sie anschließend eine Suspension von 10^5 Zellen pro Milliliter HL-60-Zellen über das Muster. Führen Sie die Suspension über Oberflächen in einer rechteckigen Durchflusskammer mit Neigungswinkeln des Rezeptormusters von 10 Grad.
Bei Raumtemperatur von 24,5 Grad Celsius. Stellen Sie die Spritzenpumpe so ein, dass eine Flussrate von 75 Mikrolitern pro Minute mit einer entsprechenden laminarer Scherspannung von 0,5 Dyn pro Quadratzentimeter erzeugt wird. Nehmen Sie nun mit einem umgekehrten Mikroskop und einer montierten Kamera das Rollverhalten von HL-60-Zellen auf.
Wechselwirkungen mit adhäsiven p, Selektin und Substraten. Verwenden Sie ein 4x-Objektiv mit einer Rate von einem Bild pro Sekunde über einen Zeitraum von 300 Sekunden. Führen Sie drei unabhängige Experimente durch.
Stellen Sie die Daten als Mittelwert und Standardabweichung der aus jedem Experiment erhaltenen Durchschnittswerte dar. Mikroskopieaufnahmen, umgewandelt aus dem Video von HL 60.Rolling. Interaktionen mit adhäsiven p-Selectin- und Substraten zeigen helle und dunkle Bereiche, die jeweils den p-Selectin-Rezeptor- und PEG-Bereichen entsprechen.
Die Spuren werden hier mithilfe eines angepassten MATLAB-Programms abgegrenzt. Der Neigungswinkel der Kante betrug 10 Grad und die Scherspannung 0,5 Dyn pro Quadratzentimeter. Weitere Analysen basieren auf der Verteilung der Kantenverfolgungslänge, dem Durchschnittswert der Kantenverfolgungslänge sowie VE und VP, den Rollgeschwindigkeiten an der Kante und innerhalb der Bänder.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Zelltrajektorien auf asymmetrischen Rezeptormustern untersucht.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll beobachtet und analysiert Zellwanderungsbahnen auf asymmetrischen Rezeptormustern, um die Entwicklung von Rezeptormuster-Substraten für die markierungsfreie Zellseparation und -analyse zu unterstützen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Biomaterialien
- Mikrofluidik
Hintergrund
- Das Zellwälzen ist ein entscheidender Prozess bei verschiedenen biologischen Wechselwirkungen.
- Asymmetrische Rezeptormuster können das Zellverhalten beeinflussen.
- Markierungsfreie Techniken sind entscheidend für die Zellseparation und -analyse.
- Die Mikrokontaktdrucktechnik ist eine nützliche Methode zur Herstellung strukturierter Substrate.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Beobachtung des Rollverhaltens von Zellen auf rezeptorstrukturierten Substraten.
- Analyse der Trajektorien rollender Zellen zur Verbesserung der Substratentwicklung.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die Dynamik der Zellbewegung unter Strömungsbedingungen.
Verwendete Methoden
- Mikrokontaktdruck von PEG-Molekülen auf einem Goldsubstrat.
- Erzeugung abwechselnder Muster von selbstassemblierenden Monoschichten.
- Auffüllen des Substrats mit P-Selectin und Rezeptoren.
- Einbau in eine Durchflusskammer und Abbildung rollender HL-60-Zellen auf Mustern.
Hauptergebnisse
- Bildsequenzen von HL-60-Zellinteraktionen wurden aufgezeichnet.
- Die Trajektorien rollender Zellen wurden mithilfe von MATLAB analysiert.
- Daten zur Kantenverfolgungslänge und zu Rollgeschwindigkeiten wurden gewonnen.
- Erkenntnisse über die Zellbewegung auf asymmetrischen Rezeptormustern wurden gewonnen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht eine detaillierte Analyse der Zellwanderungsdynamik.
- Asymmetrische Rezeptormuster können für eine effektive Zellseparation konstruiert werden.
- Diese Methode trägt zum Verständnis des Zellverhaltens unter Scherströmung bei.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der Wälzbewegung von Zellen auf asymmetrischen Rezeptormustern ermöglicht die gezielte Konstruktion mikrofluidischer Trennvorrichtungen ohne Markierung. Dieses Protokoll liefert quantitative Daten zur Länge der Randverfolgung und zur Wälzgeschwindigkeit unter definiertem Schubspannungsgradienten und unterstützt damit die Vorhersage des Zellverhaltens in Strömungssystemen. Solche Erkenntnisse reduzieren den empirischen Aufwand bei der Geräteentwicklung für Zellaufreinigungs- und phänotypische Analyseverfahren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Kinetik der Ligand-Rezeptor-Bindung unter physiologischer Scherbelastung und liefert damit Erkenntnisse zur Zielvalidierung für adhäsionsvermittelte Signalwege.
- Operativer Wert: Bietet ein markierungsfreies Verfahren zur Beurteilung der funktionellen Rezeptoraktivität ohne fluoreszierende Markierungen oder genetische Reporter.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messgrößen für die Rollgeschwindigkeit von Zellen und die Länge der Kantennachverfolgung zur vergleichenden Analyse bei unterschiedlichen Rezeptordichten oder Mustergeometrien.
- Operativer Wert: Standardisiert die Substratpräparation mittels Mikrokontaktdruck und Integration in die Durchflusskammer für reproduzierbare Adhäsionsassays.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominderung adhäsionsbasierter Trennstrategien, indem der Zusammenhang zwischen Rezeptormustergestaltung und beobachtbaren Zelltrajektorienausgängen hergestellt wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Zellphänotypen basierend auf Rollverhalten, was zur Anreicherung von Subpopulationen in präklinischen Modellen nützlich ist.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode eignet sich für die frühe Entdeckungsphase, um die Assay-Entwicklung und die Erzeugung präklinischer Werkzeuge zu unterstützen, insbesondere für Zielstrukturen, bei denen Adhäsion unter Flussbedingungen als funktioneller Endpunkt dient.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen unter Scherströmung und klärt die mechanistischen Beiträge zum Zellwälzen.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Adhäsionsmetriken, die den Vergleich von Zelllinien oder Rezeptormodulatoren ermöglichen.
- Analytik: Erstellt Verteilungen der Kantenverfolgungslänge und der Wälzgeschwindigkeit und bietet damit eine statistische Grundlage für den Vergleich von Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Wälzdynamiken mit der potenziellen Anwendung in markierungsfreien Zellseparationsgeräten für die präklinische Probenvorbereitung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung adhäsionsvermittelter Zellverhalten über mehrere Zielstrukturen und Zelltypen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei adhäsionsbasierten Trennmechanismen, indem Trajektorienparameter unter kontrollierter Scherbelastung quantifiziert werden.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisiertes Mikrokontaktdrucken, Rezeptor-Nachfüllen und Aufbau der Durchflusskammer.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Risiken in fortgeschrittenen Entwicklungsphasen von Geräten, indem eine funktionelle Validierung von Rezeptormustern in frühen Entwicklungsstadien ermöglicht wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen für mikrofluidische Trenntechnologien, indem empirische Daten zur Leistung von Mustern bereitgestellt werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrokontaktdruck, Oberflächenchemie und Mikrofluidik-Strömungssteuerung.
- Setzt den Zugang zu invertierter Hellfeldmikroskopie, Hochgeschwindigkeitskamera und auf MATLAB basierenden Partikel-Tracking-Tools voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Herstellung der Substrate und der Dokumentation der Strömungsbedingungen, um die Reproduzierbarkeit an mehreren Standorten zu gewährleisten.
- Die Anpassung auf alternative Zelltypen erfordert die Validierung von Ligand-Rezeptor-Paaren und die Optimierung der Scherspannungsparameter.
- Eingeschränkt durch die vorübergehende Natur der Zellrand-Interaktionen, was die vollständige Rekonstruktion der Trajektorien erschwert und eine segmentierte Analyse notwendig macht.
