Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

Dieses Verfahren dient zur Untersuchung der Wirkung kleiner GTP-Acylase-Enzyme (GTP ACEs) auf die polarisierte Membranvesikeltransport. Zunächst werden DNA-Plasmide, die die kleine GTP ACE und die Reportereiweiße kodieren, in die Zellkerne polarisierter Zellen koinjiziert. Anschließend wird die DNA unter Temperaturbedingungen exprimiert, die die Reportereiweiße im endoplasmatischen Retikulum oder im trans-Golgi-Netzwerk (TGN) arretieren, während die kleine GTPA im Cytosol akkumuliert; danach wird der Transport der Reportereiweiße zur Zelloberfläche in Gegenwart von Cycloheximid verfolgt, um eine weitere Proteinsynthese zu verhindern.

Schließlich markieren Sie das Reporterprotein an der Zelloberfläche zur Immunfluoreszenzanalyse. Die mit diesem Assay erhaltenen Ergebnisse ermöglichen die Visualisierung der Veränderung der Oberflächenlokalisation mittels konfokaler Mikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie trans transfect besteht darin, dass bei der kurzen Dauer der Überexpression, die durch Mikroinjektion erreicht wird, sekundäre Effekte minimal sind, sodass wir die primären Effekte der Proteine von Interesse untersuchen können.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zellpolarität zu beantworten, beispielsweise wie kleine GTPas den polarisierten Membrantransport regulieren. Eine visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist entscheidend, da die einzelnen Schritte, die für eine erfolgreiche Mikroinjektion erforderlich sind, ohne visuelle Unterstützung schwer zu erklären sind. Isolieren Sie endotoxinfreie Plasmadesoxyribonukleinsäure mit dem Endotoxin-Free-Maxi-Prep-Kit von Sigma Aldrich gemäß dem Herstellungsprotokoll. Verwenden Sie für dieses Experiment drei klare Transwell-Filter mit 12 Millimeter Durchmesser und einer Porengröße von 0,4 Mikrometer zur Kultivierung.

Die Zellen werden mit viermal 10 hoch fünf MDCK-Zellen pro Filter beimpft. Nach zwei Tagen die Kultur unter dem Mikroskop untersuchen, um zu überprüfen, ob die Zellen in einer geschlossenen Einzelschicht wachsen. Für die Mikroinjektion.

Am Tag der Mikroinjektion 360 mal 15 Millimeter Platten mit fünf Litern MM-Wachstumsmedium plus 15 Millimeter Heis vorbereiten und in einen 39 Grad Celsius warmen Inkubator stellen. Zusätzlich drei 12-Loch-Platten mit je einem Milliliter MEM-Wachstumsmedium plus 50 Millimolar Heis und 0,1 Milligramm pro Milliliter Cycloheximid vorbereiten und in einen 31 Grad Celsius warmen Inkubator stellen. Das Mikroinjektionsmikroskop einschalten, das wie dieses umgekehrte Mikroskop mit beheiztem Objekttisch, 10×- und 32×-Objektiven sowie einem Eppendorf Femto-Jet eingerichtet ist.

Stellen Sie die beheizte Probebühne auf 39 Grad Celsius ein. Öffnen Sie außerdem den Stickstoffgasbehälter, der mit dem Lufttisch verbunden ist. Verdünnen Sie nun die DNA mit filtriertem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter.

Anschließend DNA in einer Einor-Mikrozentrifuge 30 Minuten bei 13.000 U/min zentrifugieren. Den oberen Anteil abnehmen und in ein neues Röhrchen überführen. Danach bereiten Sie die MDCK-Zellen vor, indem Sie mit dem Skalpell den ersten Filter aus der Kulturschale entnehmen, den Filter aus dem Filterhalter ausschneiden und in die vorbereitete 60 mal 15 Millimeter große Platte geben, die fünf Milliliter auf 39 Grad Celsius erwärmtes MEM-Wachstumsmedium plus 50 Millimolar Heis enthält.

Um den Filter in der Kulturplatte zu beschweren, platzieren Sie das chirurgische Skalpell in der Mitte des Filters und übertragen Sie anschließend die Kulturplatte auf den beheizten Objekttisch des Mikroskops. Geben Sie zwei bis drei Mikroliter der verdünnten DNA in eine Mikroinjektionsnadel. Drehen Sie die Schutzkappe der Nadel ab und lassen Sie sie zu Boden fallen.

Um die Nadel in den Halter einzusetzen, drücken Sie die Menütaste der Injektionseinheit und vergewissern Sie sich, dass das Ventil geschlossen ist. Schrauben Sie die Nadel in ihren Halter ein. Achten Sie darauf, die Nadel nicht zu fest anzuziehen.

Da dies zu einer Beschädigung führen könnte, drücken Sie erneut die Menütaste. So wird der angewendete Kompensationsdruck verhindern, dass das Medium während des Mikroinjektionsverfahrens in die Nadel gesaugt wird. Tippen Sie abschließend auf den Joystick, um die gespeicherte Nullposition zu löschen und die Nadel auf die Zellen abzusenken.

Verwenden Sie das 10x-Objektiv und bringen Sie die Nadel in den Lichtstrahl über der Flüssigkeit. Fokussieren Sie nun auf die Zellen. Fokussieren Sie erneut nach oben, indem Sie das Fokusrad um 180 Grad nach oben drehen, und finden Sie die Nadel.

Bewegen Sie die Nadel langsam in den Fokus. Bringen Sie sie dann erneut aus dem Fokus. Arbeiten Sie darauf hin, die Zellen erneut in den Fokus zu bringen.

Bewegen Sie die Nadel erneut in den Fokus. Wiederholen Sie dies, bis die Nadel die Oberfläche des Mediums berührt, wobei ein Halo beobachtet wird. Fahren Sie fort, bis die Zellen scharf im Fokus sind, die Nadel jedoch weiterhin unscharf außerhalb der Fokusebene liegt.

Wechseln Sie nun zum 32x-Objektiv und finden Sie die groben Einstellungen. Stellen Sie die Z-Grenze ein, indem Sie die apikale Membran mit der Nadelspitze berühren und etwa 10 Mikrometer subtrahieren, da sich die Kerne ungefähr 10 Mikrometer unterhalb der apikalen Membran befinden.

Bewegen Sie die Nadel nun so schnell wie möglich einige Mikrometer aus der Fokusebene heraus. Zielen Sie mit der Nadel über den Zellkern und drücken Sie die Injektionstaste des Joysticks kurz an und wieder los. Beginnen Sie mit 95 PSI, um den richtigen Injektionsdruck zu finden.

Wenn der Druck zu hoch ist, platzen die Zellen. Wenn der Druck zu niedrig ist, bleibt ein weißer Punkt sichtbar, aber sonst geschieht nichts. Führen Sie eine erfolgreiche Injektion durch, bei der ein Phasenwechsel stattfindet, ohne dass sich die Zellgröße verändert.

Injizieren Sie 100 bis 500 Zellen in das Loch der chirurgischen Klinge, die auf den Zellen liegt. Anschließend stellen Sie die Zellen zusammen mit der Kulturschale und der chirurgischen Klinge in einen Inkubator bei 39 Grad Celsius und inkubieren für zwei Stunden. Schließlich überführen Sie die Zellen in die vorbereitete 12-Loch-Platte mit einem Milliliter MEM plus 50 Millimolar 0,1 Milligramm pro Milliliter Cyclohecid und inkubieren zwei Stunden bei 31 Grad Celsius.

Um eine Ausbleichung des exprimierten GFP-Signals zu vermeiden, schützen Sie die Proben während aller nachfolgenden Schritte für die Oberflächenfärbung vor Licht, indem Sie sie mit Aluminiumfolie abdecken. Geben Sie die Zellen in eine Kulturschale auf eine Metallplatte auf Eis und waschen Sie sie einmal mit eiskaltem PBS plus plus. Platzieren Sie ein sauberes Stück Paraform auf der Metallplatte auf Eis und pipettieren Sie 30 µL-Tropfen eines Antikörpers, der die ecto-Domäne des Proteins von Interesse erkennt.

Platzieren Sie nun den Filter mit den Zellen verkehrt herum auf den Tropfen und geben Sie einige Tropfen Antikörper auf die Rückseite des Filters. Inkubieren Sie eine Stunde auf Eis. Waschen Sie die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS plus plus und fixieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 3 % Paraformaldehyd.

Spülen Sie die Zellen anschließend einmal mit PBS plus plus und äquilibrieren Sie sie fünf Minuten lang in PBS plus plus. Inkubieren Sie die Zellen nun in einem blockierenden permeabilisierenden Puffer. Führen Sie die Inkubation eine Stunde bei Raumtemperatur durch, verdünnen Sie die primären Antikörper im Verhältnis 1:200 im BPB, um das exprimierte RAB GTP ACE nachzuweisen, zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 13.000 U/min und pipettieren Sie 30 Mikroliter der Antikörperlösung auf eine saubere Param, die in einer feuchten Kammer platziert ist.

Platzieren Sie die Zellen umgedreht auf die Antikörpertropfen und inkubieren Sie eine Stunde lang. Danach bringen Sie die Zellen bei Raumtemperatur wieder richtig herum in eine 12-Loch-Platte zurück und waschen sie nach der Inkubation mit den geeigneten sekundären Antikörpern fünfmal innerhalb von 30 Minuten mit BPB bei Raumtemperatur, einschließlich eines Waschschritts.

Tauchen Sie die Zellen auf dem Filter dreimal in entionisiertes Wasser und geben Sie sie mit der richtigen Seite nach oben auf Objektträger mit 10 Mikrolitern Montagemedium. Legen Sie ein 18 mal 18 Millimeter großes Deckglas darauf und drücken Sie vorsichtig mit einem Papiertaschentuch das Deckglas auf die Zellen. Versiegeln Sie abschließend mit Nagellack bei der Scheininjektion, bei der nur das Plasmid zur Kodierung von V-S-V-G-T-S-O 45 GFP verwendet wird. Das Protein wird auf die basolaterale Oberfläche gut polarisierter MDCK-Zellen gebracht, wie die rote Oberflächenfärbung in Zellen zeigt, die nicht gut polarisiert sind.

Ein Teil des GFP-Fusionsproteins wird an die apikale Membran transportiert. Wenn die Kontrollpräparate so aussehen, sind die Daten nicht vertrauenswürdig, und das Experiment sollte mit besser polarisierten Zellen wiederholt werden. Beachten Sie, dass nicht die gesamte exprimierte GFP-Fusion während der Verfolgung bei 31 Grad Celsius an die basolaterale Membran geliefert wird, wie das ausgedehnte intrazelluläre grüne Signal für das Gesamtprotein zeigt. Sobald die Technik beherrscht ist, sollte sie nach ihrer Entwicklung etwa 10 bis 12 Stunden in Anspruch nehmen.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich des Membrantransports, regulatorische Proteine in polarisierten epithelialen Zellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteine in polarisierten epithelialen Zellen mittels Mikroinjektionstechnik exprimiert werden können.