Räumlich-zeitliche Manipulation kleiner GTPase-Aktivität in subzellulären Ebene und auf Zeitskala von Sekunden in lebenden Zellen

In diesem Video wird eine Methode demonstriert, bei der UV-Licht verwendet wird, um die Aktivität eines Proteins an der Plasmamembran zu steuern. Dazu werden Zellen gleichzeitig mit einem membranverankerten FRB-Protein und dem FKBP-gekoppelten Protein der Untersuchung transfiziert. Ein photolabil geschützter Rapamycin-Derivat wird dem Medium hinzugefügt.

Anschließend wird während der Live-Cell-Bildgebung UV-Licht auf einen bestimmten Bereich der Zelle angewendet. Der Linker zwischen Rapamycin und Biotin wird gespalten, wodurch der chemische Dimerisierungshilfsstoff und sein Nebenprodukt freigesetzt werden; der freigesetzte Dimerisierungshilfsstoff diffundiert in die Zellen und induziert die Dimerisierung zwischen dem mit FKBP markierten Protein der Untersuchung und dem an der Plasmamembran verankerten FRB im bestrahlten Bereich. Ohne UV-Strahlung assoziieren sich FKBP und FRB nicht, wodurch keine Wirkung entsteht.

Die Analyse der Daten zeigt eine stark lokalisierte Rekrutierung des FKBP-gekoppelten Proteins von Interesse aufgrund seiner physiologischen Wirkung. Der Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der pharmakologischen oder genetischen Herangehensweise liegt in der Kombination aus Schnelligkeit der Wirkung, Zielgenauigkeit und räumlicher Auflösung. Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Therapie von Krebsmetastasen, die eine Folge der Migration von Krebszellen sind.

Daher könnte die gezielte Beeinflussung der Aktivität zentraler Migrationsfaktoren deren präzisen molekularen Wirkmechanismus aufdecken, was eine Voraussetzung für ihre Behandlung und Heilung darstellt. Den Ablauf demonstrieren Chris Paul Meyer, ein Doktorand, und Bob de Rose, ein Techniker aus meinem Labor. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen Plasmid-DNA, membrangebundenen, fluoreszenzmarkierten FRB-FKBP, TIA1 und deionisiertes Wasser zusammengeben. Fügen Sie der Mischung ein Mikroliter Vektor-HD hinzu und wirbeln Sie sie kurz an.

Inkubieren Sie das Reagenzglas bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Während dieser Inkubation geben Sie 50 Mikroliter Poly-D-Lysin in jedes Loch einer achtlochigen Glaskammer hinzu und inkubieren für eine Minute, um die Oberfläche zu beschichten. Danach aspirieren Sie die Lösung und waschen die Mitte jedes Lochs mit 50 Mikrolitern entionisiertem Wasser. Als Nächstes wird Trypsin bei NIH 3T3-Zellen mit 80 bis 85 % Konfluenz verwendet.

Nachdem sich die Zellen gelöst haben, 10 Milliliter DMEM mit 10 % FBS hinzufügen, 375 Mikroliter der Suspension in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen überführen und drei Minuten bei 1.500 × g zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Medium vorsichtig abpipettieren. 750 Mikroliter DMEM mit 10 % FVS und Resus hinzufügen.

Suspendieren Sie das Pellet, indem Sie es mehrmals vorsichtig auf- und abpipettieren. Geben Sie schließlich die Zellsuspension zur Transfektionslösung hinzu und rühren Sie vorsichtig mit der Pipettenspitze um. Fügen Sie 250 Mikroliter der Zelltransfektionssuspension in jede Kammer des Wells hinzu. Verschieben und inkubieren Sie die Probe.

37 Grad Celsius für 15 bis 18 Stunden. Um den Cage-Rapamycin-Biotin-Addukt herzustellen, beginnen Sie mit der Herstellung einer einmillimolaren Stammlösung von CRB in DMSO in einem sterilen Zentrifugenröhrchen; in einem separaten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen lösen Sie ein Milligramm Avadon in 250 Mikrolitern PBS auf.

Als Nächstes das Caging-Motiv an Rapamycin koppeln. Geben Sie 0,5 Mikroliter der CRB-Stammlösung zu gelöstem AVID hinzu, mischen Sie mehrmals durch Invertieren und inkubieren Sie anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur. Um die konjugierte CRB-AVID-Lösung zu erhalten und ungebundene kleine Moleküle auszuschließen sowie CRBA zu reinigen, pufferen Sie eine G-25-Größenausschluss-Säule mit 300 Mikrolitern PBS an.

Wiederholen Sie den Vorgang fünfmal, nachdem die Säule equilibriert wurde. Geben Sie 125 Mikroliter der CRBA-Lösung auf das Zentrum der Säule. Zentrifugieren Sie die Lösung anschließend zwei Minuten bei 800 ×g bei Raumtemperatur und sammeln Sie den Durchlauf in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen nach der Transfektion der Zellen.

Das Medium durch DMEM ohne FBS ersetzen, um die Zellen serumfrei zu inkubieren, und 12 Stunden lang inkubieren. Nach der Inkubation das Medium vorsichtig abpipettieren und 250 Mikroliter der vorbereiteten einmikromolaren CRBA-Lösung hinzufügen. Um anschließend die Proteindynamik in lebenden Zellen zu visualisieren, ein Spinning-Disk-Konfokalmikroskop mit UV-Beleuchtung verwenden, um die Optik an UV-LED-Licht mit 365 Nanometern zu koppeln.

Bei epifluoreszierendem Licht. Definieren Sie die Koordinaten und Größe eines Beleuchtungsflecks, indem Sie eine Glasplatte verwenden, die mit fluoreszierenden Farbstoffen beschichtet ist, die durch UV-Licht angeregt werden. Dies ermöglicht eine feine Abstimmung des zu bestrahlenden Bereichs.

Platzieren Sie die Kammerplatte mit den Zellen unter Verwendung eines 100×-Objektivs und Epifluoreszenz auf dem Mikroskoptisch. Bringen Sie die Zellen in den Fokus und suchen Sie eine Zelle. Beginnen Sie mit der Aufnahme der Bilder, nachdem Sie die Hintergrundwerte des physiologischen Effekts bestimmt haben.

Hier wird die Membranwellenbildung gemessen, indem UV-Licht in ein gewähltes Quadrant der Zelle eingestrahlt wird, wodurch der entkäfigte, ursprüngliche Rapamycin in DMSO und anschließend in PBS auf eine Endkonzentration von 400 Nanomolar gelöst wird. Geben Sie 100 Mikroliter der Lösung in die Abbildungskammer, um globale Effekte hervorzurufen. Erfassen Sie alle 15 Sekunden Fluoreszenzbilder über einen Zeitraum von 20 Minuten, um zu bestimmen, ob eine lokalisierte Aktivierung von RAC die Bildung lokaler Ruffles induzieren kann.

NIH-3T3-Zellen wurden mit dem mit YFP markierten RAC-Aktivator FK bp, TIA eins und LDR, einem membranverankerten Protein, transfiziert. Die FRB-lokalisierte Bestrahlung am Zellrand, die durch den gelben Kreis angezeigt wird, wurde gefolgt von einer globalen Beleuchtung mit einer Quecksilberlampe für eine Sekunde beginnend bei 1063 Sekunden. Wie hier zu sehen ist, war zu Beginn nahezu keine Membranwellung vorhanden.

Jedoch nach lokaler Beleuchtung wurde räumlich begrenztes Ruffling beobachtet, nach globaler Beleuchtung und Zugabe von Rapamycin, das die Translokation von FK bp TIA eins zur Plasmamembran verursacht. Die Zelle zeigte eine globale Ruffle-Bildung, was darauf hindeutet, dass die zuvor beobachtete lokale Ruffle-Bildung durch räumlich begrenzte Aktivierung von Rack verursacht wurde. Für eine quantitative Analyse wurden Zielzellen in vier Quadranten unterteilt und die Häufigkeit der Ruffle-Bildung in jedem Quadranten nach lokaler sowie nach globaler Stimulation bestimmt, wie in diesem Diagramm dargestellt.

Keine der beobachteten Zellen zeigte Ruffle-Bildung mit CRBA ohne UVA-Bestrahlung oder lokaler UVA-Bestrahlung, weder mit noch ohne Aden im Gesamtmedium. Wenn jedoch CRBA hinzugefügt wurde und eine UVA-Bestrahlung durchgeführt wurde, war die Ruffle-Bildung in etwa gleich stark, etwa 90 % in allen Quadranten bei globaler Bestrahlung. Wenn nur Quadrant eins bestrahlt wurde, lag die Häufigkeit der Ruffle-Bildung bei 100 %, verglichen mit 30 %, 25 % und 30 % in den Quadranten zwei bis vier. Diese Ergebnisse zeigen, dass die lokalisierte Freisetzung von Rapamycin genutzt werden kann, um hochlokalisierte physiologische Effekte in einer einzelnen Zelle hervorzurufen.

In diesem Fall verursacht die Aktivierung von Rack Membranruffles. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die räumliche und zeitliche Kontrolle der Aktivität kleiner G-TPas durch Licht erreichen kann. Diese Methode könnte auf jeden physiologischen Prozess angewendet werden, der von der Translokation spezifischer Proteine zur Plasmamembran abhängt.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass Lösungen, Reagenzien und Zellen für jeden Durchgang frisch hergestellt werden müssen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit UV-Licht äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von UV-Schutzbrillen stets beachtet werden sollten.