Physiologische, morphologische und neurochemische Charakterisierung von Neuronen Modulated durch Bewegung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die physiologische Reaktion einzelner Neuronen während der Bewegung aufzuzeichnen und weitere Charakterisierungen hinsichtlich Morphologie und Neurochemie dieser Neuronen vorzunehmen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Tier anästhesiert und chirurgisch präpariert wird. Im nächsten Schritt erfolgt die elektrophysiologische Aufzeichnung der intrazellulären Antwort einzelner Neuronen während der Bewegung.

Nach der Perfusion des Tieres und Aufarbeitung des Gehirns besteht der letzte Schritt darin, die physiologische Reaktion und die neuronale Morphologie zu visualisieren und zu analysieren. Letztendlich kombinieren die Techniken der intrazellulären Neuronenableitung, der Immunchemie und der Analyse, um die Modulationen im Membranpotential einzelner Neuronen während der Bewegung aufzuzeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Zellkultur liegt darin, dass neuronale Verbindungen und synaptische Eingänge erhalten bleiben und die Neuronen weder ex autotomisiert noch in künstliche Medien überführt werden. Am Tag zuvor injizieren Sie einen neuronalen Tracer, beispielsweise Meerrettichperoxidase, in die peripheren Zielregionen, um motorische Neuronen retrograd zu markieren.

Am nächsten Tag das Tier anästhesieren und es auf eine Heizplatte legen, die Haut über dem hinteren Schädel mit einem Tiertrimmer unter aseptischen Bedingungen rasieren. Einen Schnitt entlang der Innenseite des Oberschenkels durchführen, eine Kanüle in die Vena femoralis zur zusätzlichen Anästhesie einführen. Eine weitere Kanüle in die Arteria femoralis einführen, um den Blutdruck zu überwachen.

Schließlich wird eine Kanüle in die Luftröhre eingeführt. Anschließend wird die Ratte in einen stereotaktischen Halter platziert. Es wird eine Kraniotomie durchgeführt, um das Kleinhirn freizulegen, wobei darauf geachtet wird, den großen venösen Sinus zu vermeiden, der sich direkt unter der Verbindung zwischen den Parietal- und Interparietalknochen befindet.

Danach die Oberfläche des Gehirns mit erwärmtem Paraffinöl bedecken. Nun den Unterkiefer an einen Stab kleben, der mit einem elektromagnetischen Vibrator gekoppelt ist. Die Bewegung des Unterkiefers wird durch Steuersignale an den Vibrator von einem Signalgenerator gesteuert.

Als Nächstes platzieren Sie eine Erdungselektrode unter der Haut neben der Kraniotomie. Zur Vorbereitung der intrazellulären Elektroden ziehen und füllen Sie Mikroelektroden mit einer IDE- oder Tetraethylrodomin-Farbstofflösung. Die Elektrodenimpedanz beträgt 60 bis 80 Megaohm für Axone mit großem Durchmesser und 80 bis 150 Megaohm für kleine afferente Axone und Interneurone.

Als Nächstes platzieren Sie die Mikroelektrode mit Hilfe eines kleinen, hinter dem Kopf des Tieres fest montierten Teleskops in die Kopfstufe des Elektrometers. Visualisieren Sie die Mikroelektrode durch das 20×-eingeschlossene Rotationsprisma des Teleskops. Das Zielgebiet liegt etwa 0,5 Millimeter kaudal zur unteren Grenze des unteren Hügels.

Erstellen Sie nun eine kleine Öffnung in der Pia mater, um die genaue Lokalisation der Gehirnoberfläche zu ermöglichen. Überkompensieren Sie die Kapazitätsrückkopplung, sodass beim Kontakt der Elektrode mit dem Gehirn ein Rückkopplungssignal erzeugt wird. Führen Sie die Elektrode vor, bis sie in das Gehirn eindringt.

Der nächste Schritt besteht darin, eine wiederholte Verschiebung des Unterkiefers zu aktivieren. Anschließend führen Sie die Elektrode mithilfe eines Schrittmotors in das Gehirn ein. Sobald ein neuronaler Kontakt durch einen plötzlichen Abfall des DC-Potentials und fortlaufende synaptische Aktivität angezeigt wird, stoppen Sie die Vorwärtsbewegung der Elektrode.

Wenn die Penetration als stabil eingestuft wird, beginnen Sie mit Ramp-and-Hold- und sinusförmigen Kieferbewegungen. Zeichnen Sie die neuronale Antwort auf und charakterisieren Sie das Neuron anhand seiner Reaktion. Anschließend kartieren Sie das rezeptive Feld des Neurons, indem Sie mit einer stumpfen Sonde die Haut um den Kopf sowie die intraorale Kavität untersuchen.

Untersuchen Sie die Reaktion des Neurons auf andere Reize wie Muskelkontraktion oder nozizeptive Reize. Wenn die Ableitungen abgeschlossen sind, injizieren Sie ein bis vier Nanoampere Gleichstrom für eine Gesamtinjektion von 15 bis 70 Nanoampere-Minuten. Überwachen Sie das Eindringen der Elektrode und stellen Sie die Strominjektion ein.

Wenn das Membranpotenzial positiver als minus 30 Millivolt wird, folgt als nächster Schritt das Schneiden des Gehirngewebes. Nach der Tötung und Perfusion des Tieres wird das Gehirn entnommen. Anschließend schneidet man 50 bis 100 Mikrometer dicke Schnitte in frontaler, sagittaler oder horizontaler Ebene.

Um die Beziehung zwischen dem markierten sensorischen Neuron und einer Vielzahl von Motoneuronen zu visualisieren, bearbeiten Sie das Gewebe mit H-R-P-D-A-B oder Texas red, abhängig vom Gewebe; zusätzliche Analysen können mit einem fluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop oder mithilfe von Software zur quantitativen Kolokalisation durchgeführt werden. Bei Bedarf kann eine immunchemische Bearbeitung für Synaptophysin durchgeführt werden, um Synapsen innerhalb der markierten Neuronen genau zu lokalisieren. Diese Abbildung zeigt ein Hirnstammneuron, das nach elektrophysiologischer Charakterisierung mit IDE injiziert wurde.

Aufgrund der neuronalen Reaktion während der Bewegung kann dieses Neuron als sekundäres afferentes Muskelspindelneuron identifiziert werden. Die braune Umrandung zeigt die Lage des Nucleus motorius nervi trigemini an. Diese Abbildung zeigt die physiologische Reaktion eines sensorischen Neurons während einer Kieferverlagerung.

Die Antwort des Neurons wird als momentane Feuerungsfrequenz dargestellt. Beachten Sie, dass die Antwort der Kieferverlagerung eng folgt, was darauf hinweist, dass dieses spezielle Neuron sensorische Rückmeldung bezüglich der Kieferposition liefert. Diese Abbildung zeigt ein sensorisches Neuron, das während der Muskeluntersuchung reagiert hat.

Das Neuron wurde nach der immunochemischen Aufarbeitung mit Ide angefärbt. Die synaptischen Knöpfchen, die als rote Schwellungen erscheinen, zeigen eine koloralisierte Verteilung mit dem gelben Synaptophysin. Grün ist eine fluoreszierende Markierungsfärbung.

Diese Abbildung zeigt eine Animation eines Axons eines primären afferenten Neurons aus einem Muskelspindelorgan. Mehrere optische Schnitte des markierten Neurons wurden zur Erzeugung der Animation verwendet. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Elektronenmikroskopie, konfokale Mikroskopie sowie anterograden oder retrograden neuronale Markierungstechniken durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der ultrastrukturellen Merkmale des Neurons, der Kolokalisation von Neurotransmittern mit synaptischen BNS und der neuronalen Vernetzung zu beantworten.