Induktion von Alloantigen-spezifische Anergie in humanen peripheren mononukleären Zellen durch Alloantigen Stimulation mit Co-stimulatorische Signal Blockade

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, allospezifische Spender-T-Zellen durch eine ex vivo-Stimulation mit allogenen Antigenen des Empfängers zu aktivieren, wobei Antikörper vorhanden sind, die die kostimulatorische Wirkung von antigenpräsentierenden Zellen auf T-Zellen über deren CD28-Rezeptor blockieren. Dies wird erreicht, indem zunächst PBMC von zwei verschiedenen gesunden Spendern isoliert werden. Anschließend wird eine umfassende allogene Aktivierungskultur eingerichtet, indem die HLA-ungleichartigen PBMC-Populationen in Gegenwart monoklonaler Antikörper gegen die Liganden B7.1 und B7.2 inkubiert werden, um die CD28-Stimulation zu hemmen.

Anschließend wird die Wirksamkeit der Allo-Aktivierung durch primäre und sekundäre gemischte Lymphozytenreaktionen oder MLR gemessen. Schließlich wird die Allo-Spezifität der Allo-Aktivierung durch die Bestimmung von Reaktionen gegen Drittpersonen und gegen CMV-spezifische Antigene ermittelt. Es werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, dass die T-Zellen des Spenders gegenüber nachfolgenden alloantigenen Stimuli hyporeagibel werden, während nicht alloreaktive Spender-T-Zellen erhalten und funktionsfähig bleiben.

Wir haben diese Strategie bereits erfolgreich in früheren und laufenden klinischen Pilotstudien zur Infusion allospezifisch aktivierter Spender-T-Zellen während und nach einer HLA-inkompatiblen Stammzelltransplantation eingesetzt und beobachtet, dass die Immunrekonstitution verbessert war, Infektionen seltener auftraten und akute sowie chronische Graft-versus-Host-Erkrankungen weniger schwerwiegend verliefen als bei historischen Kontrollen von Empfängern unbehandelter HLA-inkompatibler Transplantate. Ein wesentlicher Vorteil der Strategie der Allo-Anodisation besteht darin, dass Nebenwirkungen minimiert werden, da die Technik die auf Pathogene oder tumorassoziierte Antigene spezifischen T-Zell-Antworten nicht beeinträchtigt und CD4-positive regulatorische T-Zellen nicht aus dem Spender-T-Zell-Pool entfernt. Dies zeigt, dass das Verfahren sicher ist. Christine Vin, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in unserem Labor, wird den ersten Schritt durchführen. Dieser besteht darin, Blut von zwei gesunden freiwilligen Spendern zu entnehmen.

Zellen von einem Spender dienen als Reagierende und Zellen eines anderen Spenders dienen als Stimulatoren. Isolieren Sie anschließend PBMC aus dem Blut mittels Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Fial Pac. Belassen Sie eine kleine Menge der Zellen in Trypanblau und zählen Sie lebensfähige PBMC mit dem Hämozytometer Reus.

Verwenden Sie spendende PBMCs von jedem Spender in 10 Milliliter vollständigem Kulturmedium bei einer Konzentration von 1 Million vitalen Zellen pro Milliliter in separaten kegelförmigen 15-Milliliter-Röhrchen. Weisen Sie ein Röhrchen mit PBMCs eines Spenders als Stimulatoren und das andere als Respondern zu, um die allogene Bulk-Kokultur zur Aktivierung einzurichten.

Fügen Sie 100 Mikrogramm Anti-B7.1- und Anti-B7.2-Antikörper zu dem mit „Stimulator“ gekennzeichneten 15-Milliliter-Röhrchen hinzu. Vorsichtig schwenken und 30 Minuten inkubieren. Nach der Inkubationszeit die stimulierenden PBMCs bestrahlen und sie einem T25-Zellkulturkolben mit 50 Kubikzentimetern Inhalt und gasdurchlässigem Verschluss hinzufügen.

Beschriften Sie den Kolben mit der Bulk-Allo-Kohlenkultur. Geben Sie anschließend 10 Milliliter Responder-PBMCs vom anderen Spender mit einer Konzentration von einer Million pro Milliliter in komplettem Medium in den Kolben. Fügen Sie weitere 100 Mikrogramm jedes der Antikörper 7.1 und Antib 7.2 zum Kolben hinzu und mischen Sie vorsichtig, bevor Sie den Kolben für 72 Stunden aufrecht in einen Inkubator stellen.

Als Nächstes bestrahlen Sie weitere 10 Millionen der stimulierenden PBMC für eine Bulk-Kontroll-Kokultur ohne blockierende Antikörper und geben Sie diese in ein T-25-Zellkulturgefäß mit einem Fassungsvermögen von 50 Kubikzentimetern. Beschriften Sie das Gefäß als Bulk-Kontroll-Kokultur. Geben Sie 10 Milliliter der gleichen responierenden PBMC, die auch für die Bulk-allo-aktivierende Kokultur verwendet wurden, mit einer Dichte von einer Million pro Milliliter in komplettem Kulturmedium hinzu und mischen Sie vorsichtig, bevor Sie das Gefäß für 72 Stunden aufrecht in einen Inkubator stellen.

Der nächste Schritt besteht darin, die Funktion des allo-aktivierten Spender-T-Zell-Pools am selben Tag wie die Bulk-Co-Kulturen zu messen, indem man eine U-förmige 96-Well-Platte für die primäre MLR für jeden der drei zu messenden Zeitpunkte beschriftet. Anschließend gießen Sie fünf Milliliter aus jeder der Bulk-Control- und allo-aktivierenden Co-Kulturen in 15-Milliliter-Röhrchen ab.

Als Nächstes pipettieren Sie 200 Mikroliter Zellsuspension aus jedem Röhrchen in jeweils drei Wells auf jeder der drei Platten. Kennzeichnen Sie diese Wells als keine ko-stimulatorische Blockade oder keine CSB für die Zellen aus den Bulk-Kontroll-Kaltkulturen und als CSB für die Zellen aus den Bulk-allo-aktivierenden Kaltkulturen. Fügen Sie anschließend je 200 Mikroliter vollständiges Medium in sechs Wells auf jeder Platte als negative Kontrollen hinzu.

Schließlich 200 Mikroliter PBS zu allen leeren Vertiefungen hinzufügen, um die Verdunstung zu reduzieren, und die Platten 72 Stunden nach dem Ansatz der Bulk-Kokulturen in den Inkubator stellen; eine UBO-96-Well-Platte für die sekundäre MLR für jeden der drei zu messenden Zeitpunkte beschriften. Um die Respondierzellen für die sekundäre MLR vorzubereiten, jeweils fünf Milliliter aus den Bulk-Kontroll- und allo-aktivierenden Kokulturen in 15-Milliliter-Röhrchen überführen und die Röhrchen fünf bis zehn Minuten bei 2000 U/min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Anschließend die Zellen noch zweimal waschen, indem das Überstandsmaterial vorsichtig abpipettiert, die Zellpellets aufgelöst, jedem Röhrchen jeweils 10 Milliliter komplettes Medium zugesetzt und nach dem zweiten Waschschritt die Zellen erneut zentrifugiert werden.

Suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter komplettem Medium. Verwenden Sie Tripanblau-Färbung, um die lebensfähigen Zellen zu zählen, und stellen Sie die Zellkonzentration auf eine Million lebensfähige Effektorzellen pro Milliliter ein. Pipettieren Sie 100 Mikroliter Zellsuspension aus jedem Reagenzglas in die jeweils drei Vertiefungen jeder Platte.

Bezeichnen Sie diese Vertiefungen zunächst als First-Party- oder FP-Allo-Stimulationsvertiefungen. Pipettieren Sie anschließend 100 Mikroliter Zellsuspension aus jedem Reagenzglas in jeweils drei weitere Vertiefungen pro Platte und kennzeichnen Sie diese Vertiefungen als CD3/28-Stimulations-PBMC. Verwenden Sie die aktivierten und Kontroll-Kokulturen als Stimulatorzellen für die sekundäre MLR. Suspendieren Sie 10 Millionen PBMC des First-Party-Donors in einer Konzentration von einer Million pro Milliliter und bestrahlen Sie sie.

100 µL bestrahlte Stimulatorzellen in die Vertiefungen mit der Bezeichnung fp allo Restimulation auf jeder sekundären MLR-Platte geben. Für die positiven Kontrollen jeweils 1 µL CD3- und CD28-Einzelklonantikörper sowie 98 µL komplettes Medium in die Vertiefungen mit der Bezeichnung CD3/28-Stimulation auf jeder sekundären MLR-Platte hinzufügen. Zusätzlich 200 µL komplettes Medium in sechs leere Vertiefungen jeder Platte geben, um als negative Kontrollen zu dienen, und 200 µL PBS in alle leeren Vertiefungen geben, um Verdunstung zu reduzieren.

Stellen Sie die Platten in den Inkubator. Der nächste Schritt besteht darin, die Spezifität des alloreaktiven PBMCs zu messen, das von einem neuen gesunden Spender, dem sogenannten Drittpartei-Spender, isoliert wurde und zur Überprüfung der Spezifität des alloreaktiven Prozesses in einer sekundären MLR verwendet wird. Suspendieren Sie die PBMCs des Drittpartei-Spenders bei einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter und bestrahlen Sie die mit „3 96“ gekennzeichneten Platten für die Überprüfung der sekundären MLR-Spezifität am dritten, fünften und siebten Tag.

Um die Antwortzellen für die sekundäre MLR zur Bestimmung der Spezifität vorzubereiten, überführen Sie fünf Milliliter aus jeder der jeweiligen Kontroll- und allo-aktivierenden Koinkubationen in 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf bis zehn Minuten bei 2000 U/min. Anschließend waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie vorsichtig den Überstand abpipettieren, die Zellpellets auflockern, jedem Röhrchen jeweils 10 Milliliter komplettes Medium hinzufügen und nach dem zweiten Waschschritt die Zellen erneut zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen abschließend in einem Milliliter komplettem Medium.

Verwenden Sie die Trypanblau-Färbung, um die Zellen zu zählen, und stellen Sie die Zellkonzentration auf eine Million lebensfähige Effektorzellen pro Milliliter ein. Pipettieren Sie anschließend 100 Mikroliter Zellsuspension aus jedem Reagenzglas in dreifach vorhandene Vertiefungen auf jeder Platte. Beschriften Sie diese Vertiefungen als TP oder third party allo Stimulation. Geben Sie dann 100 Mikroliter bestrahlte TP-Stimulatorzellen zu den als TP allo Stimulation gekennzeichneten Vertiefungen hinzu.

Um die Spezifität alloreaktiver Antworten weiter zu testen, werden die Reaktionen auf Pathogene nach der Stimulierung von PBMCs von Spendern mit zuvor nachgewiesenen proliferativen Antworten gegen CMV untersucht. Beschriften Sie 3 96-Well-Platten für die sekundäre M-L-R-C-M-V am Tag drei, fünf und sieben und überführen Sie jeweils fünf Milliliter aus den Bulk-Kontroll- und allo-stimulierenden Kulturansätzen in 15-Milliliter-Röhrchen. Anschließend waschen, zählen und resuspendieren Sie die Zellen in komplettem Medium auf eine Konzentration von einer Million pro Milliliter. Pipettieren Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension aus jedem Röhrchen in drei Vertiefungen jeder Platte und beschriften Sie diese Vertiefungen als CMV-Stimulation.

Fügen Sie dann 0,1 Mikroliter CMV-Lysat in 100 Mikroliter vollständigem Medium zu den mit „CMV-Stimulation“ beschrifteten Vertiefungen hinzu. Fügen Sie anschließend 200 Mikroliter vollständiges Medium zu sechs Vertiefungen pro Platte als negative Kontrollen hinzu. Schließlich geben Sie 200 Mikroliter PBS in alle leeren Vertiefungen, um Verdunstung zu verringern, und stellen Sie die Platten in den Inkubator, um die Proliferation in primären und sekundären MLR zu messen.

Fügen Sie 16 Stunden vor der Entnahme der Platten eine Mikrocurry Tritium-markiertes Thymidin zu den Negativkontroll- und Zellkulturbrunnen hinzu. Sammeln Sie das Thymidin mit einem TomTec-Harvester oder einem ähnlichen Gerät auf einem Filtermat für jede Platte. Trocknen Sie die Filtermatten eine Stunde lang.

Danach in einzelne Probenbeutel geben. Jeweils fünf Milliliter Szintillationsflüssigkeit hinzufügen und verschließen. Messen Sie die Thymidin-Inkorporation in den letzten 16 Stunden des Experiments durch Auslesen der Filtermatten mit einem Wallac Micro Beta Szintillationszähler oder einem vergleichbaren Gerät unter Verwendung von HLA-inkompatiblen Stimulator- und Responder-PBMCs.

Es ist in dieser Abbildung zu erkennen, dass die Anwesenheit einer kostimulatorischen Blockade im primären MLR die mittlere alloreaktive Proliferation der reagierenden PBMC am fünften Tag auf etwa 30 % des Werts senkt, der im Kontroll-primären MLR ohne kostimulatorische Blockade beobachtet wird. Dies entspricht einer mittleren Hemmung der primären alloreaktiven Proliferation von etwa 70 % am fünften Tag. Wie in dieser Abbildung dargestellt.

Es ist in dieser Abbildung zu erkennen, dass die sekundäre MLR-Erstpartei-allogene Proliferation allogen aktivierter PBMC am fünften Tag typischerweise 10 bis 15 % derjenigen von Kontroll-PBMC beträgt. Dies entspricht einer mittleren Proliferationshemmung von 85 bis 90 %, was zeigt, dass allogen aktivierte PBMC hypoantwort auf allogene Erstparteistimulatoren sind. Wie in dieser Abbildung zu sehen, können, einmal beherrscht, Bulk-Kokulturen mit allogen aktivierten peripheren mononukleären Blutzellen des Spenders innerhalb von zwei bis drei Stunden eingerichtet werden.

Der Ansatz kann leicht für die klinische Anwendung standardisiert werden, um Donor-T-Zellen mit reduzierter alloreaktiver Aktivität, aber erhaltener pathogenspezifischer Immunität zu erzeugen. Solche Zellen können im Rahmen einer allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation adoptiv übertragen werden, um die Immunrekonstitution zu verbessern, ohne dass eine übermäßige Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit auftritt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, schnell zu arbeiten.

Dies trägt zur Erhaltung der Zellviabilität bei und verhindert unspezifische Aktivierung oder Verlust von antigenpräsentierenden Zellen. Falls kryo-konservierte PBMC als Stimulatoren oder Responder verwendet werden, sollte ein validiertes Protokoll zur Rekonstitution gefrorener Zellen angewendet werden, das durchgängig hohe Ausbeuten an vitalen Zellen liefert. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man allogene humane Spenderzellen aus peripheren mononukleären Blutzellen gewinnt und wie man Assays durchführt, um die Wirksamkeit und Spezifität dieses Verfahrens zu bewerten. Die Strategie kann genutzt werden, um humane Spender-T-Zellen mit verminderten alloreaktiven Antworten zu erzeugen, die klinisch zur Verbesserung der Immunrekonstitution nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation eingesetzt werden können.