Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials und Reactive Oxygen Species in Live Rat kortikalen Neuronen

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das mitochondriale Membranpotential und die Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies in primären kortikalen Neuronen mithilfe der fluoreszierenden Sonden TMRM bzw. H 2D CFD zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Stammlösungen und Arbeitskonzentrationen von TMRM und H 2D CFDA hergestellt werden. Im zweiten Schritt werden die kortikalen Neuronen 45 Minuten lang bei Raumtemperatur in Thai-Roads-Puffer mit TMRM und H 2D CFDA inkubiert.

Der dritte Schritt besteht darin, die Fluoreszenzintensität von TMRM und DCF in lebenden kortikalen Neuronen unter Verwendung von 515/517 nm bzw. 488/515 nm Anregungs- und Emissionswellenlängen zu messen. Die Änderungen der TMR-Fluoreszenz werden in Gegenwart des mitochondrialen Entkopper FCCP überwacht, während die Änderungen der DCF-Fluoreszenz in Gegenwart von Wasserstoffperoxid beobachtet werden. Der letzte Schritt dieses Verfahrens ist die Sammlung, Normalisierung und Analyse der Daten.

Schließlich werden die Ergebnisse durch die Erstellung eines Diagramms erhalten, das die relativen Konzentrationen der TMRM- und DCF-Fluoreszenzintensität vor und nach der Behandlung mit FCCP bzw. Wasserstoffperoxid zeigt. Hallo, ich bin Joanna Koska. Willkommen in meinem Labor an der Loyola University Chicago.

Heute zeigen wir Ihnen, wie man das mitochondriale Membranpotential und reaktive Sauerstoffspezies in kortikalen Neuronen von Ratten misst. Das Verfahren wird von dhi demonstriert. Hallo, ich bin Denise Jossi.

Mithilfe dieses Verfahrens kann das mitochondriale Membranpotential auf Einzelmitochondrien-Ebene und die reaktiven Sauerstoffspezies auf Einzelzell-Ebene gemessen werden. Beginnen wir also. Bereiten Sie einen 10-Millimolar-Stock von TMRM vor, indem Sie fünf Milligramm TMRM in einem Milliliter wasserfreiem Dimethylsulfoxid auflösen und eine Minute lang verwirbeln.

Anschließend Aliquots herstellen und diese bei minus 20 Grad Celsius lagern. Vor Licht schützen und innerhalb eines Monats verwenden. Danach einen 10-Millimolar-Stock von H2DCFDA herstellen, indem 4,87 Milligramm H2DCFDA in einem Milliliter wasserfreiem Dimethylsulfoxid gelöst werden.

Entsprechend wirbeln Sie eine Minute lang und stellen Aliquots her, die bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Schützen Sie vor Licht und verwenden Sie innerhalb einer Woche, um die kortikalen Rattenneuronen zuerst mit TMRM zu beladen. Waschen Sie die kultivierten Neuronen dreimal mit Tyro-Puffer.

Dann bereiten Sie 20 Nanomolar TMRM vor, indem Sie den 10-Millimolar-TMRM-Stammlösung 1000-fach in TB verdünnen. Geben Sie anschließend zwei Mikroliter der verdünnten TMRM pro Milliliter TB hinzu. Inkubieren Sie die Neuronen 45 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit TMRM.

Nach 45 Minuten die Kulturschale auf den Mikroskoptisch montieren und die Bildaufnahme beginnen, um die kortikalen Rattenneuronen mit H 2D CFDA zu beladen; danach die kultivierten Neuronen dreimal mit tb waschen. Anschließend zwei Mikromolar H 2D CFDA herstellen, indem der 10-Millimolar-H 2D CFDA-Stammlösung 10-mal in tb verdünnt wird. Danach zwei Mikroliter verdünntes H 2D CFDA pro ein Milliliter tb hinzufügen.

Anschließend inkubieren Sie die Neuronen nach 45 Minuten 45 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit H2DCFDA. Waschen Sie die Neuronen viermal mit TB, um überschüssigen fluoreszierenden Indikator zu entfernen, bevor Bilder aufgenommen werden, um eine Live-Bildgebung der mit TMRM inkubierten Neuronen mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie durchzuführen, wobei ein Live-Zeitreihen-Programm verwendet wird. Wenden Sie niedrige Auflösung und abgeschwächte Laserleistung an, um die zur Bildaufnahme benötigte Zeit zu minimieren und eine Photo-Bleiche zu vermeiden.

Als Nächstes stellen Sie die Fokussierung der mit TMRM beladenen, montierten Neuronen unter Verwendung von reflektiertem Licht ein. Untersuchen Sie die TMRM-Fluoreszenz durch Beleuchtung bei fünf 14 Nanometer und Detektion bei fünf 70 Nanometer. Stellen Sie die Detektionsverstärkung der Kamera knapp unterhalb des Sättigungsniveaus ein, sobald alle Parameter – einschließlich Auflösung, Laserleistung, Detektionsverstärkung der Kamera und Zeitrafferintervall zur Bildaufnahme – festgelegt sind.

Ändern Sie diese Einstellungen zwischen den Experimenten nicht. Ändern Sie anschließend das Feld. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern, um Änderungen des Delta-PSI-M-Stimulus zu testen, beispielsweise kann ein Mikromolar FCCP oder zwei Mikrogramm pro Milliliter Oligomycin zugegeben werden, wodurch das mitochondriale Membranpotenzial jeweils signifikant depolarisiert oder hyperpolarisiert wird.

Diese Veränderungen äußern sich in einer Abnahme der TMRM-Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Basislinien-Fluoreszenzintensität im Fall von FCCP oder in einer Zunahme der TMRM-Fluoreszenzintensität. Im Fall eines LIGA myin sin zur Durchführung der Live-Bildgebung von Neuronen, die zuvor mit H2DCFDA inkubiert wurden, montieren Sie zunächst die Kulturschale auf dem Objekttisch eines Mikroskops und stellen Sie die Fokussierung der Zellen mithilfe von Reflexlicht ein. Untersuchen Sie die DCF-Fluoreszenz durch Anregung bei 488 Nanometern und Emission bei 515 Nanometern.

Als Nächstes stellen Sie die Laserleistung auf fünf bis 7 % ein, um eine Verstärkung und eine Auflösung von 256 mal 256 zu detektieren. Ändern Sie diese Einstellungen zwischen den Experimenten nicht. Stellen Sie anschließend die Frequenz zur Aufnahme von Live-Bildern ein.

Wählen Sie mithilfe des Zeitreihenprogramms ein neues Feld aus und beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern, um Änderungen der ROS-Spiegel zu detektieren. Behandeln Sie die Zellen mit 100 bis 200 Mikromolar Wasserstoffperoxid. Dies wird sich in einer Zunahme der DCF-Fluoreszenzintensität im Vergleich zum Ausgangsniveau widerspiegeln.

Verwenden Sie das Werkzeug für den Bereich von Interesse (ROI) aus dem LSM-Programm, um die Bereiche auszuwählen. Wählen Sie anschließend ROIs aus mitochondrialen Regionen oder ROIs aus dem gesamten Zellkörper in den Bildzellen aus, um die Fluoreszenzintensitäten von TMRM bzw. ROS zu messen.

Wählen Sie Bereiche neben den Zellen aus. Um die Hintergrund-Fluoreszenzintensität zu berechnen, nehmen Sie mehrere Messungen vor und ermitteln den Durchschnittswert der Hintergrundintensität. Subtrahieren Sie anschließend die durchschnittliche Hintergrund-Fluoreszenzintensität von den durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten der interessierenden Bereiche in jeder Zelle für jeden Zeitpunkt mithilfe von Microsoft Excel. Nach der Subtraktion der Hintergrundintensität normalisieren Sie die TMRM- oder DCF-Fluoreszenzintensität auf die Basislinien-Fluoreszenz.

Mithilfe dieser Formel verwenden Sie anschließend das SigmaPlot-Programm, um die Darstellung der Änderungen der Fluoreszenzintensität über die Zeit zu erstellen. Hier sehen Sie ein Beispiel eines Fluoreszenzbildes von kortikalen Rattenneuronen, die mit TMRM inkubiert wurden. Die Zugabe von F-C-C-P-A, einem mitochondrialen Entkoppler, führt zu einer mitochondrialen Depolarisation und einem Verlust der TMRM-Fluoreszenzintensität.

Das Ausgangsniveau der TMRM-Fluoreszenz bleibt vor der Zugabe von FCCP stabil. Die quantitative Analyse der zeitlichen Änderungen der TMRM-Fluoreszenz zeigt eine signifikante Abnahme der TMRM-Fluoreszenz nach der Zugabe von FCCP. Hier sehen Sie ein Beispiel eines Fluoreszenzbildes von mit DCF beladenen kortikalen Rattenneuronen.

Das Ausgangsniveau der DCF-Fluoreszenz bleibt unverändert in den ersten 120 Sekunden vor der Zugabe von Wasserstoffperoxid. Die Zugabe von Wasserstoffperoxid führt zu einer Zunahme der DCF-Fluoreszenzintensität in den Zellkörpern. Zeitverzögerte Messungen der DCF-Fluoreszenz zeigen konstante Werte, die nach Behandlung mit Wasserstoffperoxid angestiegen sind.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, eine niedrige Laserleistung und eine hohe Abtastgeschwindigkeit zu verwenden, um Artefakte durch Photobleichen und Phototoxizität zu vermeiden. Viel Erfolg bei Ihrem Experiment.