Bestimmung der mitochondrialen Morphologie in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie

Unsere Forschung konzentriert sich auf die grundlegende Neuropharmakologie. Konkret untersuchen wir, wie Wirkstoffmoleküle funktionieren. Unser Ziel ist es, den Zusammenhang zwischen potenziellen Wirkstoffen und der mitochondrialen Funktion bei der Parkinson-Krankheit zu verstehen.

Frühere Studien untersuchen die seit langem bestehenden Herausforderungen bei der Zellanalyse im Labor, selbst wenn die Herstellerrichtlinien eingehalten werden. Um dieses Problem zu lösen, haben wir ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Beurteilung der mitochondrialen Morphologie in Laborzellen entwickelt. Unser Protokoll verwendet eine einfache mitochondriale Färbung, Fluoreszenzbildgebung und Open-Source-Software.

Dies senkt die Kosten, erhöht die Zugänglichkeit und macht es einfacher zu bedienen als komplexe Alternativen wie die Elektronenmikroskopie. Besorgen Sie sich zunächst Kulturen von SH-SY5Y-Zellen, die in Kolben gezüchtet wurden, die DMEM/F12 enthalten, ergänzt mit 10 % FBS. Trennen Sie die Zellen eine Minute lang mit einer 0,05%igen Trypsinlösung.

Zentrifugieren Sie dann die Zellen drei Minuten lang bei 100 G, bevor Sie sie passieren. Als nächstes suspendieren Sie die SH-SY5Y-Zellen in DMEM/F12-Medium, das mit 1 % FBS ergänzt ist. Anschließend säen Sie die Zellen auf konfokale Schalen mit Glasboden aus und pflegen sie über Nacht.

Für die MPP+-Stimulation ersetzen Sie das Kulturmedium 24 Stunden lang durch frisches Medium mit oder ohne 1-Methyl-4-phenylpyridinium. Für die MitoTracker-Färbung verdünnen Sie die MitoTracker-Stammlösung mit vorgewärmtem DMEM/F12-Medium, um eine Arbeitskonzentration von 50 Nanomolar zu erhalten. Bewahren Sie die Färbelösung während des gesamten Eingriffs lichtgeschützt auf.

Nehmen Sie das Nährmedium aus den konfokalen Schalen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit frischem DMEM/F12. Pipettieren Sie dann einen Milliliter der MitoTracker Arbeitslösung in die Schale.

Inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Entfernen Sie nun die MitoTracker Arbeitslösung und spülen Sie das Geschirr zweimal mit DMEM/F12 ab. Nach der letzten Wäsche je einen Milliliter DMEM/F12 in jede Schale geben.

Inkubieren Sie vor der Bildgebung im Zellinkubator. Um das konfokale Mikroskop für die Bildgebung vorauszuäquilibrieren, passen Sie unter dem Erfassungspanel die Strahlengangparameter an, indem Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen einstellen. Stellen Sie die Lochblendengröße auf 1,2 luftige Einheiten, die Pixelscangröße auf 1024 x 1024, die Pixelverweilzeit auf 2,4 Mikrosekunden mit einer Mittelwertbildung von zwei ein.

Verwenden Sie nun das Halogenlicht, um die Zellen mit einer planapochromatischen 60-fach-Objektivlinse mit einer numerischen Apertur von 1,4 zu fokussieren, um die Phototoxizität zu minimieren. Stellen Sie die Laserleistung und die Hochspannung knapp unter dem Sättigungsgrad ein. Stellen Sie dann den Zoomfaktor auf drei ein und nehmen Sie die Bilder auf.

Verschieben Sie den interessierenden Bereich, um sich auf andere Zellen unter dem Mikroskop zu konzentrieren. Nehmen Sie dann Bilder auf, ohne Einstellungen zu ändern. Um die Bildqualität vor der binären Transformation und Skelettierung zu verbessern, öffnen Sie zuerst das Bild.

Wählen Sie mit dem ROI-Tool einen Bereich einer einzelnen Zelle aus. Klicken Sie nun nacheinander auf Prozess, Filter und Unschärfemaskenfunktion, um die Schärfe zu verbessern. Verwenden Sie dann den Prozess und verbessern Sie den Kontrast, um die Rauschverstärkung zu reduzieren.

Klicken Sie auf Prozess, Filter und die Option Median, um Salz- und Pfefferrauschen zu entfernen. Um das Bild in eine Binärdatei umzuwandeln, klicken Sie auf Verarbeiten gefolgt von Binärdatei und wählen Sie die Option Binär erstellen. Skelettieren Sie das Binärbild, indem Sie auf Verarbeiten, Binär und Skelettieren klicken.

Gruppieren Sie dann alle Skelettpixel, indem Sie Analysieren auswählen, gefolgt von Skelett und 2D-3D-Funktion Skelett analysieren. Vereinfachen Sie die Analyse, indem Sie mit dem MiNA-Tool neun beschreibende Parameter im skelettierten Bild berechnen. Die Fluoreszenzintensität der mitochondrialen Färbung stieg mit der MitoTracker red CMXRos-Konzentration schrittweise von 25 Nanomolar auf 200 Nanomolar an.

Bei 200 Nanomolaren wurde jedoch eine erhebliche zytoplasmatische Hintergrundfärbung beobachtet. Die mitochondriale Morphologie war im DMEM/F12-Medium eine Stunde nach der Färbung besser erhalten als im PBS-Medium, obwohl DMEM/F12 auch eine höhere Hintergrundfluoreszenz aufwies. Die Dual-Frame-Mittelung verbesserte das Signal-Rausch-Verhältnis in der mitochondrialen Bildgebung im Vergleich zum Single-Scan-Modus erheblich.

Und die Erhöhung der Pixelverweilzeit von 2,4 auf 10,8 Mikrosekunden führte zu helleren Bildern, verursachte aber Photobleaching. Zunehmende Hochspannung verstärkte das Hintergrundrauschen, während eine erhöhte Laserleistung zu Photobleaching führte. Das MiNA-Tool erzeugte konsistente Skelettierungsausgaben sowohl für schwache als auch für helle Bilder, was auf eine robuste Segmentierung über verschiedene Fluoreszenzintensitäten hindeutet, wobei das helle Bild eine 5,5-fach höhere Intensität aufwies als das schwache Bild.

Die MPP+-Behandlung bei 500 Mikromolaren störte die mitochondriale Morphologie in SH-SY5Y-Zellen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, was zu einem signifikant reduzierten mitochondrialen Fußabdruck führte.