Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die in vivo optische Auflösungs-Photoakustik-Mikroskopie oder OR-PAM der Mikrozirkulation zu demonstrieren, eine nichtinvasive und markierungsfreie Methode. Dies wird erreicht, indem zunächst das Versuchstier anästhesiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Region von Interesse zu positionieren, indem der Bildgebungs-Kopf des optischen Auflösungs-Photoakustik-Mikroskops verschoben wird; anschließend werden die Abtastparameter festgelegt und die Bildaufnahme gestartet.

Schließlich werden die Verteilungen der Gesamtsauerstoffkonzentration und der Sauerstoffsättigung von Hämoglobin durch Berechnung der mehrwellenlängenbasierten experimentellen Daten ermittelt. Die optisch auflösende photoakustische Mikroskopie beruht auf Laseranregung und ultraschallbasierter Detektion. Ein kurzer Laserstrahl wird in biologisches Gewebe fokussiert.

Die Lichtabsorption erzeugt eine vorübergehende Erwärmung und anschließend eine ultraschallartige Emission, die zur Bilderzeugung empfangen wird. Der einzigartige Vorteil von oder Pam ist die erdfreie Detektion und die außergewöhnliche Empfindlichkeit gegenüber optischer Absorption. Im Gegensatz dazu sind bestehende Reflexions- und optische Mikroskopietechnologien hauptsächlich empfindlich gegenüber optischer Streuung oder Fluoreszenz und in der Lage, in vivo eine markierungsfreie, hochauflösende Abbildung der optischen Absorption bereitzustellen. RPM hat breite biomedizinische Anwendungen in der Neurologie, Ophthalmologie, Gefäßbiologie und Dermatologie gefunden.

Die optische Auflösungs-Photoakustische Mikroskopie, oder PAMM, besteht aus optischen und ultraschallbasierten Komponenten. Die optische Bestrahlungsquelle ist ein Farbstofflaser, der von einem gepulsten Festkörperlaser gepumpt wird. Der ausgehende Laserstrahl wird durch einen Neutraldichtefilter abgeschwächt und in eine einmodige optische Faser eingekoppelt, um die Lichtzufuhr zu ermöglichen. Dadurch wird ein mechanisches Scannen des mikroskopischen Aufnahmekopfs – anstelle des lebenden Objekts – ermöglicht, um den multimodigen Laserstrahl effektiv in eine einmodige optische Faser einzukoppeln.

Zunächst wird es durch ein Pinhole mit einem Durchmesser von 50 Mikrometern gefiltert. Das Pinhole ist leicht aus der Fokusebene der Kondensorlinse positioniert, um seinen Durchmesser an den Durchmesser des Grundmodus-Strahls anzupassen. Um einen nahezu beugungsbegrenzten optischen Fokus zu erzeugen, wird das Ausgangssignal der Einmodenfaser kollimiert und füllt die hintere Apertur eines Mikroskopobjektivs.

Die ultraschallbasierte Detektion umfasst einen hausgemachten akustisch-optischen Strahlkombinator, der mit einem Ultraschallwandler verbunden ist. Der Kombinator richtet die optische Bestrahlung und die akustische Detektion koaxial aus. Eine sphärische Kavität ist in den Boden des Kombinators eingeschliffen, um eine akustische Linse mit einer numerischen Apertur von 0,5 in Wasser zu erzeugen, was bei einer zentralen Frequenz von 50 Megahertz einen akustischen Fokaldurchmesser von 43 Mikrometern ermöglicht.

Für die erste Ausrichtung ist es hilfreich, Ultraschall mit Puls-Echo-Technik zu verwenden, um die Position der akustischen Fokusebene zu bestimmen. Der Bildgebungs­kopf wird vertikal justiert, bis das maximale Puls-Echo-Ultraschallsignal beobachtet wird. Um die Nachweisempfindlichkeit zu maximieren, werden der optische und der akustische Fokus koaxial ausgerichtet (konfokal).

Ein optisch absorbierendes Zielobjekt, beispielsweise ein Stück schwarzes Isolierband, wird in der akustischen Fokusebene platziert. Anschließend wird die optische Fokusposition angepasst, um das photoakustische Signal zu maximieren. Das PAM-System umfasst außerdem elektronische Verstärker und einen Analog-Digital-Konverter, einen mechanischen Scanner sowie eine Scannersteuerung.

Das digitalisierte Signal wird zur Bildgebung an einen Computer übertragen. Die Software wandelt die Rohdaten in eine Abfolge von Querschnittsbilddaten um. Während der Objektscanner des Mikroskops das Objekt zeilenweise abtastet, können die aufgezeichneten Bilder als einzelne Querschnittsbilder, als 2D-Projektionsbilder mit maximaler Amplitude oder als 3D-Darstellungen angezeigt werden.

Ein Wassertank dient zur Aufnahme des Mikroskop-Auflichtkopfs. In eine Petrischale wird ein Bildgebungs-Fenster eingeschnitten und mit einer ultraschall- und optisch transparenten Polyethylenmembran versiegelt. Die photoakustische Welle, die vom Objekt ausgeht, wird über ein Ultraschallgel zwischen dem Objekt und der Polyethylenmembran sowie anschließend über entionisiertes Wasser in der Petrischale akustisch an den Ultraschalldetektor gekoppelt.

Diese Erfindungen und Anwendungen verfügbarer Optiklaser und des Ultraschallwandlers bilden das oder PAM-System. Im nächsten Abschnitt werden wir die Mikrovaskulatur einer lebenden Maus mit diesem System abbilden. Falls das zu untersuchende Tier keine Nacktmaus ist, ist es ideal, 24 Stunden vor dem Experiment die Entfernung der Haare vorzunehmen.

So erholt sich die Reizung der Hautgefäße. Betäuben Sie die Maus mit 3 % ISO-Fluor-Dampf, der in medizinischem Sauerstoff verdampft ist. Die typische Flussrate liegt zwischen einem und 1,5 Litern pro Minute.

Abhängig vom Körpergewicht des Tieres. Die Anästhesie mit 1% ISO-Fluorin während des gesamten Experiments aufrechterhalten, dabei regelmäßig einen Zehenquetschtest durchführen, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig anästhesiert ist. Die Maus auf eine stereotaktische Haltestelle mit einer Heizplatte überführen, um ihre Körpertemperatur bei 37 Grad Celsius zu halten.

Jetzt das Ohr auf der Kunststoffplatte abflachen. Anschließend eine Schicht Ultraschallgel auf das Ohr auftragen. Dabei vermeiden, dass Luftblasen im Gel eingeschlossen werden.

Tragen Sie außerdem Augensalbe auf die Augen auf, um Austrocknung oder versehentliche Laserbeschädigung zu verhindern. Vermeiden Sie es, das Auge direkt mit dem Applikator zu berühren. Bringen Sie dann das Ohr unter das Bildgebungs-Fenster und heben Sie langsam die Tierplattform an, bis das Ultraschallgel die Unterseite der Membran berührt.

Ein sanfter Kontakt ist erforderlich, da das Andrücken des Ohres gegen die Membran den Blutfluss im Ohr beeinträchtigen könnte. Als Nächstes ergreifen Sie einige Vorsichtsmaßnahmen am Tier, um dessen physiologischen Zustand zu überwachen. Befestigen Sie ein Pulsoximeter am Bein oder Schwanz der Maus.

Senken Sie nun den Abbildungskopf so weit ab, bis die akustische Linse in entionisiertem Wasser eingetaucht ist, und entfernen Sie Blasen, die sich unter der akustischen Linse festgesetzt haben. Stellen Sie den Laser auf den externen Auslösermodus und beginnen Sie mit der Testabtastung. Passen Sie die Z-Position des Abbildungskopfes an, bis sich die optischen und akustischen Doppelfoki in der Mitte des Ohrs befinden.

Stellen Sie nun die Scan-Parameter ein und beginnen Sie mit der eigentlichen Bildaufnahme. Um die Gesamtkonzentration von Hämoglobin zu messen, stellen Sie die Wellenlänge auf einen ISO-spatischen Punkt ein, an dem Oxyhämoglobin und Desoxyhämoglobin gleiche molare Extinktionskoeffizienten aufweisen.

Um die Sauerstoffsättigung des Hämoglobins zu messen, stellen Sie die zweite Wellenlänge so ein, dass die molaren Extinktionskoeffizienten von Oxyhämoglobin und Desoxyhämoglobin einen deutlichen Unterschied aufweisen. Reinigen Sie nach Beendigung das Mausohr und stellen Sie die Maus in einen Inkubator. Bei einer Umgebungstemperatur von 37 Grad Celsius bringen Sie die Maus nach dem Aufwachen natürlich in die Tierhaltung zurück.

Diese Projektionsaufnahme mit maximaler Amplitude zeigt die vaskuläre Anatomie eines lebenden Ohres einer Nacktmaus, die mithilfe von oder Pam bei 570 Nanometern aufgenommen wurde. Diese Projektionsaufnahme zeigt die Sauerstoffsättigung von Hämoglobin im selben Ohr. Sie wird aus den bei einer isospastischen Wellenlänge von 570 Nanometern und einer für die Absorption von Desoxyhämoglobin charakteristischen Wellenlänge von 561 Nanometern gewonnenen Bildern berechnet.

Ein genauerer Blick auf den markierten Bereich zeigt die Auflösung der ORPM. Ein dicht gepacktes Kapillarbett ist deutlich aufgelöst. In diesem Video haben wir das typische experimentelle Protokoll für die ORPM demonstriert, einschließlich der Systemkonfiguration, der Systemausrichtung, der in-vivo- Versuchsdurchführung und des funktionellen Abbildungsschemas.

Einer der wichtigsten Aspekte bei der Gerätekonstruktion und -bedienung ist die optisch-akustische konfokale Ausrichtung, die für die Abbildungsempfindlichkeit und die optische Auflösung entscheidend ist. Die Kombination der photoakustischen Mikroskopie mit der tiefenpenetrierenden akustischen Auflösungs-photoakustischen Mikroskopie und der photoakustischen Computertomographie verspricht in vivo funktionelle und molekulare Bildgebung auf mehreren Maßstabsebenen. Zellen, Gewebe und sogar Organe – von Organ-Nägeln bis hin zu ganzen Organen – können mit demselben Kontrast abgebildet werden. Aufgrund dieser Skalierbarkeit der Bildgebung besteht das Potenzial, die Forschung an multisystemischen biologischen Prozessen und deren Translation von mikroskopischen Laborbefunden hin zur makroskopischen klinischen Anwendung zu revolutionieren.