High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Kultivierung und Applikation fluoreszierender Stämme von CL gans für Hochdurchsatz-Screenings chemischer Bibliotheken oder zum Nachweis von Umweltkontaminanten, um die Wirkung chemischer oder umweltbedingter Substanzen auf die Aktivität spezifischer Proteine zu bewerten. Bei CL elgan werden bakterielle Kulturen zunächst als Nahrung für die Würmer und GFP-transgene Würmer vorbereitet. Synchronisierte Würmer werden kultiviert.

0,5 bis 2 Millionen Würmer werden anschließend gesammelt, gewaschen und auf 3 84-Well-Mikrotiterplatten verteilt; danach werden kleine Moleküle aus einer chemischen Bibliothek oder Testproben wie Wasser, Nahrung oder Boden zu den Würmern gegeben. Schließlich wird die Fluoreszenz der Würmer mit einem Mikroplattenreader gemessen.

Die Datenanalyse von Fluoreszenzintensitäten ermöglicht den Nachweis von kleinen Molekülen, die induzierbare transkriptionelle Signalwege modulieren, oder erlaubt die Detektion von Umweltkontaminanten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie in-vitro- oder Zellkultur-basierten Assays besteht darin, dass keine Zeit mit Verbindungen verschwendet wird, die in vivo toxisch oder inaktiv sind. Diese Hochdurchsatzmethode kann helfen, kleine Moleküle zu identifizieren, die vielfältige induzierbare Signalwege modulieren.

Obwohl wir diese Methode für die Hochdurchsatz-Screening von Bibliotheken kleiner Moleküle entwickelt haben, kann sie auch zur Biosensorik von Kontaminanten in Lebensmittel- und Umweltproben angewendet werden. Den Ablauf wird Andrew Dine, Techniker in meinem Labor, und Q long, Postdoktorand in meinem Labor, demonstrieren. Bereiten Sie das bakterielle Nematodenfutter rechtzeitig vor.

Beginnen Sie mit der Inokulation von 500 Millilitern hervorragender Brühe, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin mit fünf Millilitern gesättigtem e coli. OP 50. Stellen Sie die Kultur auf einen Schüttler und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag die Kultur auf 10 Röhrchen mit je 50 Milliliter aufteilen. Anschließend die Röhrchen in eine gekühlte Zentrifuge geben und 20 Minuten bei 2.500 RCF zentrifugieren. Nach der Zentrifugation jedes bakterielle Pellet in 10 Milliliter flüssigem Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM resuspendieren.

Schütteln Sie die Suspensionen horizontal. Verwenden Sie einen Plattenschüttler für 15 Minuten, um die Bakterien erneut in Suspension zu bringen. Zentrifugieren Sie danach die Bakterienkultur bei 2.500 RCF bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.

Decantieren Sie das NGM und wiegen Sie das bakterielle Pellet. Geben Sie anschließend ein gleiches Volumen an NGM-Puffer hinzu und resuspendieren Sie die Pellets durch Vortexen. Schließlich portionieren Sie drei Milliliter der resuspendierten Bakterienkultur in 15-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie diese bei minus 20 Grad Celsius, bis sie benötigt werden.

In dieser Demonstration wird als Beispiel der Effekt des stressinduzierenden Xeno Duke-Kredits auf den Transkriptionsfaktor Sskn one gemessen. Sskn one ist dafür bekannt, zytoprotektive Gene während oxidativen und xenobiotischen Stresses zu aktivieren. Es wird eine Großkultur der Trenchgenic c gans-Linie VP 5 96 vorbereitet, die zwei fluoreszierende Konstrukte enthält.

VP 5 96 Würmer exprimieren sowohl den GST-four-Promotor, der GFP antreibt und zur Überwachung der Aktivität des Transkriptionsfaktors verwendet wird, als auch den DOP-three-Promotor, der RFP antreibt und als Standard für die Normalisierung der Wurmanzahl dient.

DOP drei ist der Promotor für einen Dopaminrezeptor und wird konstitutiv in Neuronen im gesamten Körper exprimiert. Im Beispiel aktiviert das Xenobion stark sskn eins und erhöht die Menge an GFP, das vom GST vier-Promotor exprimiert wird. Um Kulturen vorzubereiten, mischen Sie zunächst 150 Milliliter N NGM-Puffer, 1,5 Milliliter LB 150, Mikroliter einer einmolaren Cholesterinlösung und 75 Mikroliter einer 100 Milligramm pro Milliliter-Streptomycinlösung. Das Hinzufügen des LB verhindert, dass die Würmer an Glas- und Plastikgefäßen haften, doch diese Menge reicht nicht aus, um das bakterielle Wachstum zu unterstützen.

Filtern Sie die Mischung zur Sterilisation und geben Sie sie in einen sterilen Ein-Liter-Kolben. Stellen Sie den Kolben beiseite, um die Eier aus den GR-Adultwürmern freizusetzen. Entfernen Sie die Bakterien von den Würmern durch Zentrifugation und Ersetzen des NGM-Mediums, bis das Überstand klar ist. Waschen Sie die Würmer ein zweites Mal, indem Sie sie in sterilem Wasser resuspendieren, erneut zentrifugieren und nach dem Zentrifugieren fortfahren.

Entfernen Sie das Überstand und füllen Sie das Röhrchen mit 3,75 Millilitern steriler Wasser. Geben Sie ein Milliliter Haushaltsbleiche und 250 Mikroliter 10 normales Natriumhydroxid hinzu und mischen Sie sofort durch fünf bis sechsmaliges Umstülpen. Stellen Sie das Röhrchen nach vierminütiger Bleicheexposition der Würmer in einen Rotator.

Stellen Sie das Röhrchen unter ein Stereomikroskop. Die meisten erwachsenen Würmer sollten liegen. Schütteln Sie das Röhrchen kräftig 15 bis 20 Mal, um verbliebene erwachsene Würmer nach der Lyse zu lösen. Nach insgesamt fünf Minuten fügen Sie steriles Wasser hinzu, bis das Röhrchen voll ist.

Mischen Sie durch fünf- bis sechsmaliges Umstülpen, um die Eier zu sammeln. Zentrifugieren Sie das Gefäß eine Minute lang bei 500 RCF. Waschen Sie die Eier dreimal mit Resus, indem Sie sie in 10 Milliliter sterilem Wasser resuspendieren, zentrifugieren und das Überstand entfernen.

Als Nächstes verdünnen Sie eine 100 µL Probe der Eier 100-fach, indem Sie 10 mL NGM-Puffer hinzufügen. Pipettieren Sie anschließend drei Aliquots zu je fünf µL unter dem Mikroskop auf den Deckel einer Petrischale. Zählen Sie die Anzahl der Eier in drei separaten Aliquots zu je fünf µL.

Um die Gesamtanzahl der Eier abzuschätzen. Geben Sie 200.000 bis 2 Millionen Eier in den Kolben mit NGM-Puffer und schütteln Sie die Kultur bei 100 U/min bei 20 Grad Celsius. Mindestens 16 Stunden nach Zugabe der Eier zum Kolben verwenden Sie eine sterile serologische Pipette, um etwa 0,5 Milliliter der suspendierten Wurmkultur zu entnehmen.

Pipettieren Sie drei Tropfen à fünf Mikroliter auf den sterilen Deckel einer Petrischale. Legen Sie den Deckel für ein bis zwei Minuten in einen Minus-20-Grad-Gefrierschrank, um die Würmer zu paralysieren, sobald die Würmer paralysiert sind. Zählen Sie mithilfe eines Stereomikroskops die durchschnittliche Anzahl lebend geschlüpfter Würmer pro fünf Mikroliter, um die Gesamtanzahl abzuschätzen.

Tauen Sie die zuvor zubereitete gefrorene OP 50-Bakterienkultur auf, indem Sie sie einige Minuten lang auf den Labortisch stellen. Geben Sie anschließend drei Milliliter 50%ige OP 50 pro 500.000 geschlüpfte Würmer hinzu. Schütteln Sie den Kolben bei 100 U/min und 20 Grad Celsius.

Die Würmer entwickeln sich in etwa 51 Stunden zu L4-Larven und jungen adulten Stadien. Überwachen Sie die Menge der Bakterien während der Inkubation durch visuelle Inspektion. Fügen Sie weitere Bakterien hinzu, wenn das Medium klar wird.

Überführen Sie mit einer sterilen serologischen Pipette etwa 0,5 Milliliter der suspendierten Wurmkultur auf eine standardmäßige NGM-Agarplatte. Untersuchen Sie die Würmer mit einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass sich die Mehrheit in der Larvenstufe L4 und als junge Erwachsene unter Hellfeldmikroskopie befindet; Larven der Stufe L4 weisen eine klare ventrale Stelle in der Körpermitte auf. Junge Erwachsene sind leicht größer und besitzen keine klare Stelle.

Ziehen Sie als Nächstes die Wurmkultur in sterile 50-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie die Röhrchen in einem Reagenzglasständer in der Abzugshaube ab und lassen Sie sie ruhen, um unbefruchtete Eier oder Würmer, die sich nicht entwickeln, abzusetzen. Diese setzen sich langsamer ab als entwickelte Würmer.

Nach 10 Minuten das Überstand entfernen, der ungehäutete und nicht entwickelte Würmer enthält, durch Aspiration von etwa 10 Milliliter NGM-Puffer zu jedem Pellet und die Würmer durch vorsichtiges Schwenken der Röhrchen suspendieren. Alle Würmer in einem einzigen 50-Milliliter-Röhrchen sammeln. Im Schwenkkorbzentrifugen bei 500 RCF für 30 Sekunden zentrifugieren.

Suspension der Würmer anschließend in 50 Milliliter NGM mit 1 % LB zur Wäsche. Dieser Schritt ist drei bis viermal zu wiederholen, um die Bakterien nach der Wäsche zu entfernen. Das Gefäß mit NGM plus LB-Puffer auf 50 Milliliter auffüllen.

Geben Sie dies in einen speziellen Wurm-Abgabekolben mit einem Rührstab und stellen Sie ihn auf ein Rührgerät. Es werden mindestens etwa 20 Milliliter oder 60.000 Würmer benötigt, um den Totraum des Abgabekolbens und der Dosierkassette zu füllen. Zählen Sie die Anzahl der Würmer in drei Tropfen zu je fünf Mikroliter, wie zuvor gezeigt.

Nach dem Zählen an NGM plus LB auf eine Konzentration von 12 bis 15 Würmern pro Tropfen von fünf Mikroliter benötigt jede 384-Well-Platte etwa 35.000 Würmer oder 11,5 Milliliter suspendierte Würmer. Laden Sie eine 10-Mikroliter-Dosierkassette in den Dosierer ein und sterilisieren Sie sie, indem Sie sie mit 70 %igem Ethanol spülen. Spülen Sie das Ethanol aus, indem Sie mit sterilem Wasser nachspülen.

Führen Sie das Ende der Dosierkassette in den Kolben ein, sodass sie sich knapp über dem Rührstab befindet, ohne dessen Bewegung zu stören. Achten Sie darauf, dass die Würmer während des gesamten Vorgangs in Suspension bleiben. Programmieren Sie den Dosierer so, dass er die Würmer mit niedriger Geschwindigkeit dosiert, wobei zwei Vorimpulse zum Ansaugen erforderlich sind, und geben Sie mindestens 10 Milliliter der suspendierten Würmer aus.

Füllen Sie die Mikrotiterplatten, die bereits Testverbindungen enthalten sollten, schnell, um zu verhindern, dass sich die Würmer in den Schläuchen absetzen. Hier liegt die zuvor auf die Mikrotiterplatte aufgebrachte Testverbindung Glow vor. Versiegeln Sie die Platten mit atmungsaktivem Klebeband, um zu verhindern, dass sich Staub in den Vertiefungen ansammelt.

Stellen Sie die Platten auf eine schüttelnde Plattform in einen Inkubator bei der für den Assay geeigneten Temperatur. Stapeln Sie die Platten nicht, da dies die Luftzirkulation beeinträchtigen kann. Führen Sie die Zielplatte in einen Mikroplattenreader ein, um die Fluoreszenzintensität jedes Wells mit den geeigneten Emissions- und Anregungswellenlängen zu messen.

Die für GFP verwendeten Filter sind eine Anregung bei 485 und eine Emission bei 528. Die Filter für RFP sind eine Anregung bei 540 und eine Emission bei 590. Nach dem Auslesen der Platte berechnen Sie das Verhältnis von GFP zu RFP und normalisieren es mit den Messwerten der Kontrollgefäße, die die aktivierende Verbindung nicht enthalten, um den genauen Faltunterschied der Fluoreszenzintensität zu ermitteln, der sich aus den einzelnen Behandlungen ergibt.

Der hier gezeigte SSKN-One-Assay verwendet einen chromosomal integrierten dualen Reportereinbau, eine Stamm, bei dem die Würmer manuell mit einem Stereomikroskop gezählt wurden. Die Anzahl der Würmer korrelierte mit dem dispensierten Volumen mit einem Bestimmtheitsmaß (R-Quadrat) von 0,94 und einem p-Wert von weniger als 0,0001. Dies zeigt, dass die Anzahl der in jede Vertiefung gebrachten Würmer durch Anpassung des dispensierten Volumens gesteuert werden kann.

Die Gesamt-GFP-Fluoreszenz pro Vertiefung, dargestellt links, und die RFP-Fluoreszenz pro Vertiefung, dargestellt rechts, ist in diesen Abbildungen von Vertiefung zu Vertiefung über eine 3 84-Vertiefungs-Platte hinweg hochgradig reproduzierbar. XS zeigen die relative Fluoreszenz, die in jeder Vertiefung gemessen wurde. Durchgezogene Linien kennzeichnen die Mittelwerte, gestrichelte Linien zeigen drei Standardabweichungen oberhalb oder unterhalb des Mittelwerts der Fluoreszenz aller Vertiefungen; der Variationskoeffizient lag unter 9 %. Wie in dieser Abbildung dargestellt, besteht zwischen der GFP-Fluoreszenz des GST-vier-Promotors und der RFP-Fluoreszenz des DOP-drei-Promotors über 3 84 Vertiefungen eine lineare Korrelation mit einem Bestimmtheitsmaß (R-Quadrat) von 0,62 und einem p-Wert von weniger als 0,0001.

Daher kann der nicht induzierbare RFP-Reporter zur Normalisierung des induzierbaren GFP-Reporters verwendet werden. Wenn ein Verhältnis der GFP- zu RFP-Fluoreszenz ermittelt wird, ist dieses von Vertiefung zu Vertiefung auf einer 384-Vertiefungs-Platte äußerst reproduzierbar.

Die Berechnung des Verhältnisses von GFP zu RFP verringerte den Variationskoeffizienten auf unter 6 %, was die Fähigkeit des DOP-Drei-Promotor-RFP-Reporters zeigt, die Variabilität wie hier dargestellt zu reduzieren. Die Induktion von GFP relativ zu RFP durch einen SK N eins aktivierenden Xenobiotikum ist robust und über eine 384-Well-Platte hinweg hochgradig reproduzierbar; die mittleren relativen Fluoreszenzverhältnisse aller Kontroll- und dlo-Gruben sind mit durchgezogenen Linien markiert. Drei Standardabweichungen oberhalb des Kontrollmittelwerts und unterhalb des dlo-Mittelwerts sind mit gestrichelten Linien gekennzeichnet.

Wenn man einmal Erfahrung gesammelt hat, dauert das Einrichten einer Wurmkultur etwa eine Stunde am ersten Tag sowie die Sammlung und Verteilung. Das Sammeln und Verteilen der Würmer dauert etwa zwei Stunden, wenn es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, mit mindestens 60.000 Würmern zu beginnen und sie während der Verteilung in Suspension zu halten. Nach dieser Anleitung können Bildschirme mit anderen, beispielsweise Reportersystemen für andere induzierbare Signalwege, durchgeführt werden, um Modulatoren für andere Signalwege nach deren Entwicklung zu ermitteln.

Diese Technik kann für Forscher in den Bereichen Hochdurchsatz-Screening und Biosensorik den Weg ebnen, um schnell kleine Moleküle zu identifizieren, die Signalwege modulieren, oder um Umweltkontaminanten nachzuweisen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man fluoreszierende elegan-Stämme kultiviert, dosiert und misst, um entweder induzierbare transkriptionelle Signalwege im Hochdurchsatz-Screening zu untersuchen oder mehrere Proben auf Umweltkontaminanten zu testen.