Bestimmung von Molekülstrukturen von HIV Hüllglycoproteine ​​mit Cryo-Elektronen-Tomographie und automatisierte Sub-Tomogramm Averaging

Über 60 Millionen Menschen sind mit HIV infiziert, dem Virus, das AIDS verursacht. HIV/AIDS stellt eine globale Gesundheitskrise dar, und obwohl intensive Forschungsbemühungen das Leben Infizierter dramatisch verlängert haben, bleibt ein wirksamer Impfstoff bislang aus. Ein zentraler Schwerpunkt der HIV-Impfstoffforschung ist das Hüllglykoprotein, das HIV zur Invasion von Zielzellen verwendet.

In diesem Video zeigen wir, wie wir Strukturen dieses wichtigen Proteins mithilfe einer Bildgebungstechnik namens Kryo-Elektronentomographie erhalten. Ausgehend von gereinigtem HIV, demonstrieren wir die Schritte zur Herstellung gefrorener Proben, die Aufnahme elektronenmikroskopischer Bilder dieser gefrorenen Proben sowie die Umwandlung dieser Bilder in strukturelle Modelle, die für die Entwicklung eines HIV/AIDS-Impfstoffs nützlich sein könnten. Ein besonderer Aspekt dessen, was wir in diesem Video präsentieren, ist, dass die Arbeit von Mitgliedern ihres Labors durchgeführt wird, die ein breites Altersspektrum abdecken – von Schülerinnen und Schülern der Mittel- und Oberstufe über Studierende und Doktorandinnen und Doktoranden bis hin zu Postdoktoranden und erfahrenen Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftlern.

Die Herstellung von vitrifierten Virusproben, die für die Kryo-Elektronentomographie geeignet sind, erfolgt, indem eine wässrige Virus-Suspension auf kleine Löcher in einem Kohlefilm aufgetragen wird, der von einem Kupfergitter getragen wird, und die Viren anschließend schnell eingefroren werden. Das Ziel dieses Schritts besteht darin, eine gefrorene Probe intakter Viren herzustellen, die in einem nahezu nativen Zustand fixiert sind. Zunächst werden die Gitter in eine Glühentladungseinheit eingelegt.

Dieses Gerät reinigt die Gitter, indem es sie einem ionisierten Gas aussetzt. Nachdem die Gitter nun gebrauchsfertig sind, wird eine Suspension von Viren, vermischt mit kleinen Goldpartikeln, hergestellt. Diese Partikel sind für die Datensammlung und -verarbeitung unerlässlich.

Anschließend wird ein Tropfen der Virus-Suspension auf das frisch im Plasma gereinigte Gitter gegeben. Das Gitter wird dann in einen Roboter eingelegt, der es mit Filterpapier abblottet, wodurch der Tropfen zu einem dünnen Flüssigkeitsfilm reduziert wird. Die Probe wird daraufhin in flüssiges Ethan getaucht, wodurch die Viren mit einer Geschwindigkeit von über 100.000 Kelvin pro Sekunde schnell eingefroren werden.

Der schockgefrorene Gitterträger wird anschließend zur Aufbewahrung und zum Transport zum Mikroskop in eine Lagertasche überführt. Dies wird wiederholt, bis die gewünschte Anzahl an Gitterträgern eingefroren ist. Nachdem nun die Gitterträger mit Virusproben vorbereitet sind, folgt als nächster Schritt das Einladen in das Mikroskop.

Zum Abbilden kann dies manuell oder mit robotischer Unterstützung erfolgen. Wenn die Probenraster manuell geladen werden, sitzt der Benutzer an einer speziellen Station, an der die Proben unter flüssigem Stickstoff manipuliert werden können; die Proben werden dann in eine tragbare, stickstoffgekühlte Kammer eingebracht, die verschlossen, evakuiert und anschließend am Mikroskop befestigt wird. Neuere Mikroskope ermöglichen eine stärker automatisierte Probenaufgabe.

Hier im Titan Cryos-Mikroskop werden gefrorene Proben vom Benutzer an das Mikroskop übergeben und anschließend robotisch geladen, wobei die Probenraster im Mikroskop platziert werden. Jedes Raster kann vom Benutzer vor Beginn der Aufnahme untersucht werden. Die Mikroskopparameter werden für jeden Bereich auf dem Probenraster mit interessanten Strukturen eingestellt.

In diesem Fall handelt es sich bei den Merkmalen um HIV-Viren. Während jedes neue Gebiet definiert wird, speichert der Mikroskop-Computer die gebietsspezifischen Bildgebungsparameter. Sobald der Benutzer alle Bereiche von Interesse definiert hat, kehrt der Computer automatisch zu jeder Position zurück und sammelt einen Datensatz.

Jeder Datensatz wird durch Kippen des Probenrasters bezüglich des Elektronenstrahls aufgenommen, wobei sichergestellt wird, dass der Strahl an derselben Stelle auf dem Raster fokussiert bleibt. Die Datenaufnahme in der Elektronenmikroskopie erforderte traditionell, dass Benutzer am Mikroskop sitzen und physisch mit der Ausrüstung interagieren. Diese Art der Mikroskopbedienung wird hier während eines Besuchs von Präsident Obama in einer Intel-Fabrik gezeigt.

Aktuelle Fortschritte bei den Computer-Schnittstellen von Mikroskopen ermöglichen es Benutzern, die Datensammlung in Echtzeit von einem entfernten Computer im Labor oder anderswo zu überwachen und anzupassen. Um die Formen der Hülle und der glykoproteinhaltigen Ausstülpungen sichtbar zu machen, muss die Information aus Hunderten einzelner Bilder gemittelt werden, um das Signal zu verstärken. Dies ist ein rechenintensiver Prozess, der hier mithilfe eines Computer-Clusters namens Bio Wolf durchgeführt wird.

Am NIH wurden leistungsstarke Methoden entwickelt, um einzelne Volumina zu extrahieren und die Informationen mithilfe von Algorithmen zu mitteln, die bei hohen Rauschpegeln arbeiten können. Den hierbei entstehenden Datensätzen inhärent liefern die Dichtekarten sowohl nativer Viren als auch Viren, die in Komplexen mit biologisch wichtigen Molekülen vorliegen, eine umfangreiche Informationsdatenbank zur Strukturbiologie von HIV. Die Dichtekarten gewinnen an molekularer Detailgenauigkeit, wenn die Daten mit Informationen aus der Röntgenkristallographie der einzelnen Untereinheiten kombiniert werden, aus denen der Hüllglykoprotein-Spike besteht.

Daten, die aus diesen Tomos hervorgehen, können sehr dicht und schwierig zu interpretieren sein. 3D-Software aus der Unterhaltungsindustrie kann verwendet werden, um die 3D-Modelle durch Hinzufügen von Farben, Texturen und Beleuchtung zu visualisieren und sie so leichter analysierbar zu machen. Zu der gängigen Visualisierungssoftware gehören beispielsweise Mirror 3D Studio Max und Maya.

Wir haben soeben Schritt-für-Schritt-Anleitungen dafür demonstriert, wie man molekulare Modelle für die Struktur des Hüllproteins gewinnen kann, ausgehend von gereinigtem HIV. Mithilfe dieser Methode haben wir außerdem Strukturen des Hüllproteins in Komplex mit einer Vielzahl von Molekülen bestimmt, die an das Virus binden und es nutzen können.

Hier zeigen wir ein Beispiel für die Struktur des Hüllglykoproteins in Komplex mit einem Antikörper namens B12. Zu verstehen, warum einige Moleküle das Virus binden und nutzen können, während andere dies nicht tun, ist sehr wichtig für das rationale Design von Impfstoffen. Die Aufklärung der molekularen Strukturen von Hüllglykoproteinen von HIV oder anderen Viren wie Influenza und Ebola ist entscheidend, um virale Eintrittsmechanismen und deren Nutzung zu verstehen.

Wie Sie gesehen haben, etabliert sich die Kryo-Elektronentomographie zunehmend als ein leistungsfähiges Werkzeug, um dieses Ziel zu erreichen.