Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Ich bin Frederick Dina, und ich bin außerordentlicher Professor für Pharmakologie an der Ohio State University. In dieser Demonstration zeigen wir den Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid aus Zellen mithilfe der EPR-Spin-Falle.

Reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies sind an der Entstehung verschiedener Krankheiten beteiligt, weshalb ihre Detektion in biologischen Systemen von größter Bedeutung ist. Nur wenige zuverlässige Methoden zur Nachweisung reaktiver Spezies wurden bisher in biologischen Systemen eingesetzt, doch sie sind durch begrenzte Spezifität und Empfindlichkeit eingeschränkt. Die Spin-Falle-Technik hingegen wird häufig zur Identifizierung von Radikalen verwendet und umfasst die Additionsreaktion eines Radikals an eine nitrosische Spin-Falle oder metallische Komplexe, wodurch ein persistenter Spin-Addukt entsteht, der mittels Elektronenspinresonanzspektroskopie oder EPR nachgewiesen werden kann. Die verschiedenen Radikaladdukte weisen ein charakteristisches Spektrum auf, das zur Identifizierung der gebildeten Radikale genutzt werden kann und umfassende Informationen über Art und Kinetik der Radikalerzeugung liefert.

Die Stickstoffmonoxid-Synthase katalysiert die Umwandlung von L-Arginin zu L-Citrullin unter Verwendung von NADPH zur Bildung von Stickstoffmonoxid. Unter Bedingungen oxidativen Stresses kann eNOS von der Produktion von Stickstoffmonoxid auf die Bildung von Superoxid umschalten, ein Prozess, der als Entkopplung bezeichnet wird und vermutlich durch die Oxidation des Häm oder des Cofaktors Tetrahydrobiopterin verursacht wird. Die Regulation von Stickstoffmonoxid in biologischen Systemen ist wichtig, da es eine entscheidende Rolle in der Zellkommunikation spielt und zu vorteilhaften physiologischen Funktionen wie der Vasodilatation führt. Eine übermäßige Produktion ist jedoch häufig mit entzündlichen Zuständen assoziiert. Daher ist der Nachweis von Stickstoffmonoxid in biologischen Systemen von Bedeutung.

Eine weitere wichtige Klasse von Signalstoffen in biologischen Systemen sind reaktive Sauerstoffspezies wie Stickstoffmonoxid; reaktive Sauerstoffspezies spielen in niedrigen Konzentrationen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Zellfunktion, Signalübertragung und Immunantwort, können jedoch in nicht regulierten Konzentrationen zu zellulären oxidativen Schäden führen, die oxidativen Stress verursachen. Das Superoxid-Radicalanion ist eine der wichtigsten reaktiven Sauerstoffspezies und der Hauptvorläufer einiger der stärksten Oxidationsmittel, die in biologischen Systemen bekannt sind, wie etwa Peroxynitrit und Hydroxylradikal. Die Detektion und/oder Bindung von Superoxid in biologischen Systemen ist daher wichtig, da seine Bildung das erste Anzeichen eines oxidativen Burst vor dem Beginn darstellt.

Dieses Protokoll beschreibt die Trypsinisierung von kultivierten bovinen aortalen Endothelzellen, wie in der schriftlichen Vorgehensweise beschrieben. Überführen Sie die Zellen in eine beschriftete sechswellige Platte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 nach der Inkubation.

Entfernen Sie die 6-Loch-Platte aus dem Inkubator und aspirieren Sie das Medium aus dem ersten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit je einem Milliliter Dulbeccos Phosphat-Puffer-Salzlösung oder DPBS. Bereiten Sie eine 1,9-Millimolar-Lösung aus Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat vor, indem Sie 0,8 Milligramm Eisen(II)-sulfat in ein Milliliter DPBS mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid geben.

Und bereiten Sie die MGD-Lösung vor, indem Sie 2,7 Milligramm Ammonium-MGD zu 500 Mikrolitern DPBS mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid hinzufügen. Geben Sie 210 Mikroliter frisch zubereitete 1,9-Millimolar-Lösung von Eisensulfat-Heptahydrat und 210 Mikroliter frisch zubereitete MGD unter Verwendung eines Molaritätsverhältnisses von eins zu sieben hinzu, und mischen Sie die resultierende Suspension. Fügen Sie 4,6 Mikroliter Calciumionen vier hinzu und mischen Sie die Lösung erneut durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.

Dann inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für 36 Minuten. Sammeln Sie das überstehende Supernatant in einem Eppendorf-Röhrchen. Geben Sie die EPR-Akquisitionsparameter ein: Zentralfeld von 34,27 Gauss, Modulationsamplitude von sechs Gauss und Frequenz von 9,8 Gigahertz.

Da die Parameter je nach Gerät und experimentellen Bedingungen variieren, siehe Text für andere bei diesem Gerät verwendete Parameter. Überführen Sie das Super natin in eine EPR-Flachzelle, verschließen Sie sie mit Paraffin und platzieren Sie sie in der EPR-Kavität. Nehmen Sie das Spektrum für etwa 21 Minuten bei 121 Scans und 10,4 Sekunden pro Scan auf, nachdem das Experiment durchgelaufen ist.

Verwenden Sie die Brucker WIN EPR-Verarbeitung, um die Basislinie zu korrigieren und die 2D-Spektren zu integrieren, wodurch das Hintergrundrauschen reduziert wird. Es sollte beachtet werden, dass die Scan-Zeit und die Anzahl der Scans von einem Experiment zum anderen variieren können. Auch die Methoden zur Korrektur der Basislinie können von einer Software zur anderen variieren.

Um die Enos-Entkopplung zu beginnen, entfernen Sie das Medium aus dem zweiten der sechs Vertiefungen und waschen Sie die Zellen zweimal mit je einem Milliliter DPBS. Geben Sie dann 100 Mikroliter der zubereiteten 0,5-Millimolar-Syn-eins-Lösung hinzu und ergänzen Sie das Volumen mit DPBS, das 10 % FBS enthält, auf zwei Milliliter. Inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS. Geben Sie dann 210 Mikroliter frisch zubereitete 2,8-Millimolar-Lösung von Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat und 210 Mikroliter frisch nach dem vorherigen Verfahren zubereitete 19,6-Millimolar-Lösung von MGD hinzu. Fügen Sie anschließend 4,6 Mikroliter 1,9-Millimolar-Lösung von Calciumionen vier hinzu und mischen Sie die Lösung erneut.

Wie zuvor inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 36 Minuten. Nach 36 Minuten sammeln Sie das Überstand, das sich in einem Eppendorf-Röhrchen absetzt, und überführen es in eine EPR-Flachzelle. Nehmen Sie die EPR-Spektren mit denselben Erfassungsparametern wie zuvor nach der Erfassung auf.

Verarbeiten Sie die Daten auf dieselbe Weise wie vor Beginn dieses Protokolls. Bereiten Sie eine Stammlösung von einem molaren DMPO und PBS, die 0,1 Millimolar DTPA enthält, zu. Stellen Sie anschließend eine Lösung von einem Milligramm pro Milliliter von vier durch 12 her.

Myra State 13-Acetat oder PMA in DMSO: Bereiten Sie Aliquots von je einem Milliliter der PMA-Stammlösung vor, indem Sie diese auf 10 Mikrogramm pro Milliliter in PBS verdünnen, in einem Eppendorf-Röhrchen, das ein Milligramm pro Milliliter D-Glucose und ein Milligramm pro Milliliter Albumin enthält. Stellen Sie fünf bis sechs Millionen PMN-Zellen pro Milliliter her, indem Sie in einem 1,5-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen mehrmals auf- und abpipettieren. Bereiten Sie ein Gemisch mit einem Endvolumen von 60 Mikrolitern vor, das etwa 1,6 × 10⁶ PMN-Zellen, 10 Millimolar DMPO und 0,2 Mikrogramm pro Milliliter PMA enthält.

In diesem Experiment verwenden wir ein Bruker ESP 300 X-Band-Spektrometer. Überführen Sie die Lösung in eine EPR-Flachzelle und platzieren Sie die Flachzelle dann in der EPR-Kavität. Geben Sie die EPR-Akquisitionsparameter ein: Zentrumsfeld von 3.486 Gauß, Modulationsamplitude von 0,5 Gauß und Frequenz von 9,8 Gigahertz.

Da die Parameter von einem Instrument zum anderen und je nach experimentellen Bedingungen variieren, siehe Text für die in diesem Experiment verwendeten anderen Parameter zum Erfassen der Spektren. In dieser Demonstration zeigen wir den Nachweis von Stickstoffmonoxid- und Superoxid-Radikalen unter Verwendung zweier verschiedener Spin-Fänger: Eisen-MGD und DNPO.

Wir zeigen, dass die Stimulation von Endothelzellen mit Calciumionen vier Stickstoffmonoxid produziert und die Behandlung mit gesehenem eins. Ein perines Nitrit-Donor kann die Stickstoffmonoxid-Produktion verringern, eine Stimulation von Neutrophilen hingegen mit PMA in Gegenwart einer nitro-Spinfalle ergibt aufgrund der Instabilität des ursprünglich gebildeten Superoxid-Addukts ein Hydroxylradikal-ADDA anstelle des S-Oxids. Während die Mechanismen des Spin-Fangens durch Eisen-mg-d-Nitros grundsätzlich dieselben sind, beinhaltet die Stickstoffmonoxid-Addition an Eisen-MGD eine Passiergeschwindigkeit der Reaktion, und das Eisen-MGD-Stickstoffmonoxid-Addukt ist sehr stabil.

Tatsächlich kann man die Lösung bei minus 80 Grad Celsius einfrieren, um später das EPR-Spektrum aufzunehmen, ohne dass die EPR-Signalintensität signifikant abnimmt. Die Detektion von Oxid hingegen mittels der Nitro-Spinfalle ist langsam und erfordert höhere Konzentrationen der Spinfalle im Vergleich zur eisenbasierten MGD4-Methode zur Stickoxid-Detektion.

Mehrere Ansätze wurden erfolgreich angewandt, um die Superoxid-Adduktform nachzuweisen, die wir in diesem Video jedoch nicht mehr demonstriert haben. Die Verwendung einer Flachzelle kann beispielsweise eine stärkere Superoxid-Addukt-Signalintensität aufgrund einer höheren Zelldichte ermöglichen. Ich empfehle Ihnen, den Text zu diesem Thema zu konsultieren.

Außerdem kann anstelle von DMPO ein zertifizierter Spin-Fänger wie BMPO und VMP oder der phosphorylierte Nitro-DAP-MPO verwendet werden, was stabilere Superoxid-Peroxid-Addukte liefern kann. Die Verwendung von Cyclodextrin wurde ebenfalls eingesetzt, um Superoxid-Peroxid-Addukte bei der Spin-Einfangmethode zur Detektion von US zu stabilisieren. Es wird dringend empfohlen, das EP-Spektrum unmittelbar nach der Erzeugung von Superoxid aufzunehmen.

Daher ist der Nachweis von Stickstoffmonoxid mittels Eisen-MGD weitaus effizienter, und die Hauptaufgabe, der sich derzeit die PR-Spin-Falle für Superoxid gegenübersieht, besteht darin, jene Eigenschaften zu erreichen, die bei der Bildung des Eisen-MGD-Stickstoffmonoxid-Addukts beobachtet werden: schnelle Reaktivität gegenüber Superoxid und stabile Adduktbildung. Die Entwicklung von Spin-Fallen mit schneller Reaktivität gegenüber Superoxid und Bildung stabiler Spin-Addukte wird derzeit in unserem Labor sowie von anderen Gruppen durchgeführt.