Fluoreszierende Nanopartikel für die Messung von Ionen-Konzentration in biologischen Systemen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Natriumnanosensoren für in-vitro- und in-vivo-Anwendungen herzustellen. Dies wird erreicht, indem eine Opto-Mischung hergestellt wird, die die Sensorkomponenten für die Nanosensoren enthält. In einem zweiten Schritt wird ein Tensid in wässriger Lösung ultraschallbehandelt, um es gleichmäßig zu verteilen, wodurch die Bildung von Nanosensoren ermöglicht wird, sobald das Opto hinzugefügt wird.

Anschließend wird die Opto-Mischung unter Beschallung zur wässrigen Tensidmischung gegeben, um die Nanosensoren in Lösung zu bilden. Dieses Video zeigt, dass die Sensorantwort einstellbar ist. Die Sensoren können in Herzmuskelzellen mikroinjiziert werden, und es ist ebenfalls möglich, die Sensoren subkutan in Mäuse zu injizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie fluoreszierenden Indikatorfarbstoffen besteht darin, dass wir die Sensoren auf einen dynamischen Bereich abstimmen können, der der physiologischen Umgebung entspricht, einen breiteren Bereich an Analyten messen können und verhältnisbasierte Messungen zur quantitativen Analyse durchführen können. Im Allgemeinen können Anfänger Schwierigkeiten haben, da es nach der Herstellung der Sensoren einschüchternd erscheinen kann, diese in eine biologische Umgebung einzubringen. Vorräte an trockenem Natriumionen-tetraphenylborat (NaTFPB) und Chromoionophor IV müssen vor der Herstellung des Optodes gemäß dem schriftlichen Protokoll vorbereitet werden.

Stellen Sie in einem Abzug alle Materialien in einem 1,5-Milliliter-Glasfläschchen zusammen. Verschließen Sie das Fläschchen mit einer Teflon-beschichteten Schraubkappe und durchmischen Sie es vorsichtig im Vortex, bis das gesamte PVC gelöst ist. Die Lösung sollte rot erscheinen.

Beginnen Sie mit der Herstellung der Nanosensoren, indem Sie 100 µL einer 10 mg/mL PEG-Lipidlösung in ein 4 g fassendes Glasfläschchen geben. Fügen Sie anschließend 4 mL der gewünschten wässrigen Lösung hinzu, beispielsweise 10 mM HEPES.

Synchronisieren Sie eine forzierende Spitze mithilfe eines Laborbohrhammers um sieben Millimeter in das Gefäß und wenden Sie 30 Sekunden lang eine geringe Ultraschallleistung an. In einem 0,6-Milliliter-Röhrchen geben Sie 50 Mikroliter des Optomaterials und 50 Mikroliter Dichlormethan mit der Pipette zusammen, um eine gleichmäßige Vermischung sicherzustellen. Führen Sie anschließend eine dreiminütige Ultraschallbehandlung durch.

Während der Beschallung fügen Sie 100 Mikroliter der Opto-Mischung hinzu, indem Sie die Pipettenspitze eintauchen und das gesamte Volumen in einer schnellen, gleichmäßigen Injektion zugeben. Die Lösung färbt sich blau, wenn der pH-Wert über sieben steigt, und wenn kein Natrium vorhanden ist, um das restliche THF und Dichlormethan aus der Lösung zu entfernen. Bewegen Sie die Spitze des Ultraschallsonotroden auf eine Tiefe von zwei Millimetern.

Während die verbleibenden drei Minuten vergehen, wird die Lösung trüb. Sobald die Beschallung abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nanosensor-Lös游戏副本 in eine Fünf-Milliliter-Spritze auf. Befestigen Sie ein Filtergerät und geben Sie die Nanosensor-Lösung in ein Glasfläschchen mit Schraubverschluss.

Beginnen Sie mit der Herstellung von 10 Lösungen mit schrittweise steigender Natriumkonzentration, an denen die Empfindlichkeit des Nanosensors gemessen werden kann. Kombinieren Sie nullmolarer und einmolarer Natrium-Stammlösung in 50-Milliliter-Kegelröhrchen. Geben Sie nun in eine 96-Well-Platte mit optischem Boden jeweils 100 Mikroliter jeder Natriumkonzentration in drei Vertiefungen einer Spalte.

Danach 100 Mikroliter frisch hergestellte Nanosensoren zu jedem Well hinzufügen, die Platte in ein Mikroplatten-Fluorimeter laden und die Anregungs-, Emissions- und Cutoff-Wellenlängen eingeben, die für das verwendete Chromophor optimal sind. Die Auswahl der gemessenen Wellenlängen hängt von der jeweiligen Anwendung ab. Diese Wellenlängen ermöglichen intrazelluläre Messungen schneller Dynamiken oder eine Rauschreduzierung.

Um die Alpha-Werte zu erhalten, dividieren Sie das Verhältnis der Intensität bei 570 Nanometern durch die Intensität bei 670 Nanometern oder 680 Nanometern. Tragen Sie die Alpha-Werte gegen den Logarithmus der Natriumkonzentration auf. Setzen Sie den Logarithmus der Natriumkonzentration gleich null auf minus eins.

Passen Sie nun eine sigmoïdale Kurve an die Reaktion an und berechnen Sie aus der Kurve die Natriumkonzentration, bei der der Alpha-Wert 0,5 beträgt. Dies stellt die Natriumkonzentration dar, bei der der Sensor optimal reagiert. Passen Sie mit dieser Information das Verhältnis von Natriumionophor IV, Natrium-TFPB und Chromoionophor III im Optod an, um Nanosensoren mit der optimalen Natriumkonzentration herzustellen.

Beispielsweise repräsentieren die Dosis-Wirkungs-Kurven von fünf verschiedenen Nanosensor-Sets unterschiedliche optische Formulierungen, die sich nur in der Menge von vier 10 an Natrium unterscheiden. Für die intrazelluläre Bildgebung ersetzen Sie das Zellmedium durch ein klares Medium wie Tyro-Lösung und überführen die Zellen in eine Bildgebungskammer. Füllen Sie nun eine gezogene Glaspipette nachträglich mit Nanosensorlösung, die in fünf Milligramm pro Milliliter Glukose in Wasser hergestellt wurde.

Danach befestigen Sie die Pipette an einem Mikromanipulator und schließen sie an ein druckgesteuertes Injektionssystem an. Senken Sie die Pipette auf die Zelle und in das Zytoplasma hinab. Manchmal ist es erforderlich, den Manipulatorhalter leicht anzuklopfen, um die Membran zu durchdringen.

Injizieren Sie einige hundert Pikroliter der Nanosensorlösung und ziehen Sie die Pipette schnell zurück. Betäuben Sie eine CD1-Nacktmaus mit Isofluran unter Verwendung einer Anästhesiekammer. Nach der Betäubung wird die Maus in eine desinfizierte Bildgebungskammer platziert.

Füllen Sie als Nächstes eine sterile 31-Gauge-Insulinspritze mit 10 Mikrolitern Nanosensoren mit dem entsprechenden KD in 10 Millimolar PBS. Achten Sie darauf, alle Luftblasen mit einer Pinzette zu entfernen. Greifen Sie mit der Pinzette eine kleine Hautfalte entlang des Rückens der Maus an der gewünschten Injektionsstelle.

Stechen Sie die Spritze mit der Schräge nach oben und der Nadel parallel zur Haut hinein. Ziehen Sie nun den Spritzenkolben zurück, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht in ein Blutgefäß eingedrungen ist. Um den Gegendruck zu verringern, bewegen Sie die Nadel vorsichtig nach rechts und links, um einen Hohlraum unter der Haut zu bilden.

Danach die Sensoren injizieren und die Spritze vorsichtig entfernen. Sanft Druck auf die Injektionsstelle ausüben und jegliche Lösung abwischen, die aus der Injektionsstelle ausgetreten sein könnte. Üblicherweise werden sechs gleichmäßig verteilte Injektionen entlang des Rückens durchgeführt.

Wenn die Injektionen an verschiedenen Mäusen durchgeführt werden, sollte die Nadel gewechselt werden, um Krankheitsübertragung und Kreuzkontamination zu minimieren. Nach den Injektionen sollten Helligkeitsfeld- und Fluoreszenzbilder unter Verwendung von Filtern aufgenommen werden, die eng am Anregungsemissionsspektrum der Nanosensoren liegen. Dies minimiert ebenfalls die Autofluoreszenz der Haut.

Diese neonatalen Kardiomyozyten wurden auf einem Deckglas kultiviert und mit Natriumnanosensoren injiziert. Dieses Fluoreszenzbild wurde bei einer Anregungswellenlänge von 639 Nanometern aufgenommen. Dies ist ein Hellfeldbild derselben Zellen und dies eine Überlagerung beider Aufnahmen.

Es tritt eine gewisse Sensoranhäufung auf, doch die Zellen weisen eine normale Morphologie auf. Die Sensoren haben sich gleichmäßig im Cytosol verteilt, und es erfolgte keine Anreicherung im Kern. Diese Überlagerung eines Hellfeld- und Fluoreszenzbildes zeigt neun verschiedene subkutane Injektionen von Natriumnanosensoren in den subkutanen Raum einer Nude-Maus.

Die Herstellung von Masten-Nanosensoren kann innerhalb weniger Minuten abgeschlossen werden, wenn sie korrekt durchgeführt wird, und ist auf beliebige Forschungsfragen zur Messung reversibler, echtzeitlicher Analytenflüsse anwendbar. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Nanosensoren in den intrazellulären oder subkutanen Raum zur quantitativen Messung in einem biologischen Umfeld eingebracht werden.