Formgedächtnis-Polymere für Active Cell Culture

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zellen auf einem Substrat mit einer zeitlich veränderlichen Topographie zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Formgedächtnispolymers in eine dauerhafte Form gebracht wird, die „gemerkt“ werden kann. Anschließend wird das Formgedächtnispolymers in eine vorübergehende Form gebracht, auf die später die Zellen ausgesät werden.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Formgedächtnis-Polymer durch Erhöhung der Temperatur zur Rückkehr in seine permanente Form auszulösen; abschließend können Ergebnisse erhalten werden, die mittels Fluoreszenzmikroskopie eine Veränderung des Zellverhaltens zeigen. Hallo, mein Name ist Pat Mather. Ich bin Professor für biomedizinische und chemische Verfahrenstechnik sowie Direktor des Syracuse Biomaterials Institute an der Syracuse University.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber kommerziellen oder maßgeschneiderten Vorrichtungen zum Dehnen von Zellen besteht darin, dass wir in einem einzigen polymeren System eine breite Palette komplexer Dehnungen auf Zellen anwenden können. Mein Name ist Jay Henderson. Ich bin Assistenzprofessor für Biomedizinische und Chemische Verfahrenstechnik und Mitglied des Syracuse Biomaterials Institute.

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Mechanobiologie zu beantworten, beispielsweise wie Zellen auf dynamische Veränderungen ihrer physikalischen Umgebung reagieren. Mein Name ist Kevin Davis und ich bin Doktorand an der Syracuse University im Fachbereich Biomedizinische Technik und Chemieingenieurwesen. Obwohl diese Methode Einblicke in die mechanische Biologie in 2D ermöglicht, kann sie auch für andere Systeme verwendet werden, wie beispielsweise 3D-Formänderungsgerüste für das Gewebeengineering.

Vor Beginn dieses Verfahrens bereiten Sie eine individuelle Aushärtekammer aus einem Objektträger, einem einen Millimeter dicken Teflon-Abstandshalter und einer Aluminiumplatte vor. Sichern Sie die Kammer zunächst mit kleinen Büroklammern, geben Sie dann NOA 63 mithilfe einer 18-Gauge-Nadel durch ein Loch im Teflon-Abstandshalter in die Kammer ein und stellen Sie anschließend die Kammer auf eine Heizplatte, die auf 125 Grad Celsius eingestellt ist.

Lassen Sie die Kammer nach dem Aufheizen fünf Minuten lang auf eine einheitliche Temperatur ansteigen. Härten Sie das NOA 63 20 Minuten lang aus, indem Sie eine UV-Lampe in einem Abstand von 6,5 Zentimetern zur Oberfläche des Glases positionieren. Entfernen Sie das NOA 63, während es noch warm ist, mithilfe eines Rasierklinge aus der Kammer.

Anschließend den Formgedächtnis-Polymer direkt auf der Heizplatte bei 125 Grad Celsius drei Stunden und 40 Minuten unter UV-Licht nachhärteten. Um das Formgedächtnis von NOA 63 zu charakterisieren, stellen Sie eine probestabförmige Probe her, indem Sie den gehärteten Film mit einer speziell angefertigten Stanze heiß pressen. Schließlich spannen Sie die Probe in einen dynamisch-mechanischen Analysator mit Zugvorrichtung ein.

Stellen Sie das Instrument auf kraftgesteuerten Modus ein und programmieren Sie den Prüfablauf gemäß dem schriftlichen Protokoll, das diesem Video beiliegt. Das Ergebnis des Verfahrens ist ein isotherm gehärtetes Formgedächtnispolymere oder SMP-Folie; platzieren Sie das CSMP auf einer Heizplatte und stellen Sie die Temperatur höher als die Glasübergangstemperatur ein, um den E-Modul zu verringern und das Schneiden zu erleichtern. Um einzelne Proben aus der isotherm gehärteten S- und P-Folie herzustellen.

Schneiden Sie den s- und p-Film mit einem Rasiermesser auf die gewünschte Probengröße zu. Die vorübergehende Form kann auf verschiedene Weisen fixiert werden. Hier wird eine hydraulische Laborpresse mit beheizbaren und kühlbaren Platten verwendet, um eine vorübergehende Topographie einzuprägen.

Stellen Sie zunächst die Temperatur der PLAs auf einen Wert oberhalb der Tg ein. Für diese Demonstration wurde ein Prägestempel hergestellt, indem Epoxidharz auf einer Schallplatte ausgehärtet wurde, um eine vorübergehende Form aus parallelen Rillen zu erzeugen. Der Prägestempel kann aus anderen Materialien und mit unterschiedlichen Topografien hergestellt werden, muss jedoch steifer sein als NOA 63.

Platzieren Sie die s- und p-Proben bei der Prägetemperatur mit der Oberseite nach unten auf dem Prägewerkzeug. Danach setzen Sie die Proben und das Prägewerkzeug in die Presse ein. Geben Sie eine Vorspannung von etwa 100 Kilopascal auf, um den Kontakt zwischen den Heizplatten und den Proben herzustellen, und halten Sie diese etwa fünf Minuten lang, um den Proben ein gleichmäßiges Erwärmen zu ermöglichen.

Wenn eine einheitliche Temperatur erreicht ist, wenden Sie ein bis sechs Megapascal auf die Proben an und halten Sie diese für eine Minute konstant. Der SMP wird brechen. Wenn eine größere Spannung aufgebracht wird.

Kleineren Spannungen anwenden, um Topographien mit geringeren Amplituden einzubringen. Nachdem der Druck aufgebracht wurde, die Temperatur durch die Wasserkühlung der Presse unter die TG absenken. Wenn die Temperatur unter der tg liegt, die aufgebrachte Kraft entfernen, bevor das aktive Zellkultexperiment begonnen wird.

Das UV-Licht des biologischen Sicherheitswerks wird zur Sterilisation der Proben verwendet. Ordnen Sie die Proben in sterilen Schalen ohne Deckel mit der Oberseite nach unten an und schalten Sie das UV-Licht für sechs Stunden ein. Drehen Sie die Proben danach um und legen Sie sie in neue sterile Schalen mit der Oberseite nach oben.

Schalten Sie das UV-Licht für zusätzliche sechs Stunden ein. Die Proben müssen in einen relativ stabilen Zustand gebracht werden, bevor sie mit Zellen beimpft werden. Legen Sie die Proben in eine 96-Well-Platte und geben Sie 150 Mikroliter komplettes Wachstumsmedium hinzu.

Mittleres Volumen pro Vertiefung. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator bei 30 Grad Celsius mit 5% CO2, bis die gewünschte teilweise Wiederherstellung erreicht ist. Für diese Demonstration werden die Proben 30 Stunden lang inkubiert, um eine ausreichend große Amplitude zur Ausrichtung der Zellen zu erzeugen.

Nachdem eine teilweise Wiederherstellung erreicht wurde, können die Proben mit Zellen beimpft werden. Legen Sie die Proben in eine neue 96-Well-Platte. Anschließend hier 150 Mikroliter Zellsuspension zu jeder der Proben hinzufügen, C3 H 10 t und ein halb.

Die meisten embryonalen Fibroblasten werden mit 20.000 Zellen pro Milliliter verwendet. Um isolierte Zellen zu erhalten, lassen Sie die Zellen anheften und sich auf der temporären Topographie ausbreiten, indem Sie sie 9,5 Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubieren. Im Anschluss wird die Zellmorphologie vor dem Übergang analysiert, indem Proben entnommen und Färbungen sowie Fluoreszenzbildgebung der Proben durchgeführt werden.

Dieses Material weist Autofluoreszenz über den größten Teil des UV- und sichtbaren Bereichs auf; Fluorochrome am roten Ende des Spektrums, wie beispielsweise Alexa Fluor 647, werden empfohlen, um die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren. Um die Proben zur Regeneration zu bringen, versetzen Sie die Platte in einen 37 °C warmen Inkubator und kultivieren Sie weiter für 19 Stunden. Dies ermöglicht es dem Material, sich zu erholen, und den Zellen, ihre Morphologie an die neue Topographie anzupassen. Nach der Inkubation wenden Sie geeignete Färbelösungen an, beispielsweise Phalloidin zur Abbildung filamentösen Aktins.

Im letzten Schritt können die Zellen auf der neuen Topographie abgebildet werden, hier gezeigt ist die makroskopische eindimensionale Formgedächtniswirkung einer einzelnen NOA 63-Aushärtung. Wurde dreimal wiederholt, wobei der Stern (*) den experimentellen Beginn der Aushärtung markiert. NOA 63 ist ein transparenter, glasartiger Feststoff mit hervorragenden Formgedächtniseigenschaften.

In diesem Fall wurde das Material ausgehärtet und weist eine einheitliche Tg von 51,1 Grad Celsius auf, bestimmt anhand des Beginns des Abfalls des Speichermoduls. Der hier beobachtete Abfall der Dehnung tritt bei der gemessenen Tg auf. Ein großer Prozentsatz der angewendeten Dehnung von 4,7 % wurde nach der Entlastung bei 20 Grad Celsius fixiert, was einem Fixierungsverhältnis von 89,3 % entspricht. Die fixierte Dehnung wurde anschließend bei einer Erwärmung innerhalb eines relativ kleinen Temperaturbereichs zu 84,4 % zurückgewonnen.

Die Formgedächtnisleistung zeigte über drei Zyklen hinweg keine Verschlechterung, wie alle Kurven belegen, die nahezu exakt denselben Verlauf aufweisen. Die Amplitude der temporären Topographie nimmt bei 30 Grad Celsius innerhalb von 30 Stunden ab. Bei 30 Grad Celsius.

Die Amplitude wurde gegenüber dem hier zum Zeitpunkt null angegebenen Wert um etwa 50 % verringert. In den folgenden 9,5 Stunden sinkt sie um weitere 10 %. Wenn die Erholung durch Erhöhung der Temperatur auf 37 Grad Celsius ausgelöst wird, verringert sich die Amplitude innerhalb von 9,5 Stunden auf 0,5 % der anfänglichen Amplitude für den verwendeten Präger und eine Prägebelastung von 4,9 Megapascal.

Dies entspricht einer funktionellen Veränderung von 13 Mikrometer tiefen Rillen zu einer nahezu flachen Oberfläche. Dieses Polymer erholt sich im Temperaturbereich von 30 bis 37 Grad unter Zellkulturbedingungen. Dies liegt an der Wasseraufnahme aus dem Kulturmedium; das Wasser plastifiziert das Polymer, wodurch die Tg gesenkt wird und eine Erholung bei Temperaturen unterhalb der trockenen Tg von 51 Grad ermöglicht wird.

Ein Beispiel für ein Zellverhalten, das durch die Verwendung aktiver Zellkultursubstrate gesteuert wird, ist die Veränderung der Zytoskelettmusterung auf vorübergehend gerillten Substraten. Vor der Erholung richten sich die Aktin-Mikrofilamente entlang der Rillenrichtung aus. Nach der Erholung durch Temperaturerhöhung haben sich die Mikrofilamente neu organisiert und weisen eine zufällige Orientierung auf.

Umgekehrt reorganisieren sich Kontrollproben mit statischen, flachen oder statischen Rillen nach Temperaturerhöhung nicht. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Geometrie der Härtungskammer, die Übergangstemperatur des Polymers, die Methode der Dehnungsfestlegung sowie die Zusammensetzung des Polymers selbst angepasst werden können, um den gewünschten Übergang in Ihrem eigenen Experiment nach diesem Verfahren zu erreichen. Andere Methoden wie die Echtzeit-PCR können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie sich die Genexpression als Reaktion auf die mechanische Stimulation durch das Substrat nach dessen Entwicklung verändert.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellmechanobiologie, um zelluläre Zytoskelette, Umlagerungen und die Physik weicher Materie in zwei Dimensionen zu untersuchen. Vielen Dank für Ihr Interesse an unserer Arbeit und fürs Zuschauen.