Anwenden von Mikrofluidik zur Elektrophysiologie
1. Oktober 2007
Mein Name ist Dave Edington. Ich bin Assistenzprofessor an der Fakultät für Bioingenieurwesen der University of Illinois in Chicago. Unser Hauptarbeitsgebiet ist die Anwendung mikrotechnologischer Verfahren auf biomedizinische Anwendungen, insbesondere unter Einsatz mikrofluidischer Vorrichtungen.
Und heute zeigen wir Ihnen eines unserer Projekte, bei dem ein mikrofluidisches Gerät verwendet wird, das an eine standardmäßige Perfusionskammer für Gehirnschnitte angepasst ist, um räumlich und zeitlich gezielte Stimulation eines Gehirnschnitts durchzuführen. Derzeit erfolgt in elektrophysiologischen Schnittpräparationen die Applikation von Neurotransmittern entweder global über den gesamten Gehirnschnitt – also die gleichzeitige Stimulation des gesamten Gehirnschnitts – oder mittels einer Mikropipette, mit der zu verschiedenen Zeitpunkten Neurotransmitter lokal zugeführt werden.
Die Gehirnscheibe ist eine sehr komplexe Struktur, und wenn man Neurotransmitter global appliziert oder eine Mikropipette verwendet, können in vivo-artige Stimulationsmuster nicht reproduziert werden. Mit unserer Plattform hingegen können wir die Stimulation gezielt auf sehr spezifische Bereiche der Gehirnscheibe beschränken und eine in vivo ähnlichere Stimulation erzielen. Hier sind aktuelle Perfusionsysteme dargestellt, die mit einem Standard-Deckglasobjektträger andocken.
Und diese ermöglichen es, dass das Medium über den gesamten Schnitt hinweg perfundiert wird. Allerdings können Sie die räumliche Auflösung des Neurotransmitters, den Sie mit Ihrem Stimulationsgerät verwenden, nicht gezielt steuern. Daher haben wir ein mikrofluidisches Gerät entwickelt, das mit dieser standardmäßigen Perfusionskammer verbunden werden kann.
So können alle gängigen elektrophysiologischen Assays verwendet werden. Der einzige Unterschied besteht darin, dass anstelle eines Glas-Deckglases mit Glasboden ein A-P-D-M-S-Gerät zum Einsatz kommt, das mehrere Durchgangslöcher aufweist, die mit mikrofluidischen Kanälen verbunden sind. Diese Kanäle führen zu Öffnungen in der oberen Perfusionskammer, sodass Neurotransmitter durch diese Löcher, entlang der Kanäle, durch die Durchkontaktierungen und in das Gehirnschnittpräparat hinein appliziert werden können. Zur Flüssigkeitszufuhr verwenden wir eine Technik, die als passives Pumpen bezeichnet wird.
Daher benötigen wir keine komplexen Schläuche, die aus diesem Gerät herausführen, da die Elektrophysiologie bereits ein sehr komplexes Verfahren ist. Durch die Vereinfachung des Gerätedesigns und die Verwendung einer passiven Pumpe wird der experimentelle Protokollablauf bei der Anwendung dieses mikrofluidischen Geräts vereinfacht. Die Struktur des Geräts ist ein zweischichtiges mikrofluidisches Netzwerk.
Die erste Schicht besteht aus den Leitkanälen, die mit den Auslassöffnungen verbunden sind, und die zweite Schicht umfasst diese Durchgangslöcher, die diese Kanäle mit der Vertiefung verbinden. Die Herstellung erfolgt mithilfe standardmäßiger zweischichtiger U-Mikrofertigungsschritte, bei denen einige Ausrichtungsmarkierungen sicherstellen, dass diese Durchkontaktierungen genau mittig in diesen vier Kanälen positioniert sind. Dieses Gerät ist so konzipiert, dass es mit der standardmäßigen Perfusionskammer verbunden werden kann, sodass alle gleichen elektrophysiologischen Assays verwendet werden können.
Wir können dies also an eine Elektrophysiologie-Apparatur anschließen, unser Objektiv in die Vorrichtung einführen, lokale Stimulation über unsere mikrofluidischen Kanäle bereitstellen und den experimentellen Aufbau nicht unnötig komplizierter gestalten, als es erforderlich ist. Indem wir das Gerätedesign so einfach wie möglich halten, können wir diese Plattform viel leichter verbreiten. Unsere derzeitige Struktur weist vier Vs in der Mitte unserer mikrofluidischen Kanäle auf, doch diese kann an die Anforderungen unterschiedlicher Labore angepasst werden, je nachdem, welchen Bereich des Gehirns sie untersuchen.
So könnte die eine Region das Hippocampus und die andere die äußere Großhirnrinde untersuchen. Wir könnten diese Regionen je nach Gestaltung des mikrofluidischen Geräts gezielt stimulieren. Da das Gerät keine externen Komponenten zur Funktion benötigt, genügt ein Mikropipettierer, um mit der passiven Pumptechnik auf diese Öffnungen zu pipettieren.
Das Standard-Elektrophysiologie-Labor muss keine weiteren Geräte zusätzlich zu diesem unteren Substrat anschaffen, um dieses Gerät verwenden zu können. Bisher haben wir uns in dem Projekt darauf konzentriert, die mikrofluidischen Kanäle mit den standardmäßigen Perfusionskammern zu verbinden. Der nächste Schritt des Projekts besteht nun darin, dieses Gerät in echter hypothesenbasierter Forschung mit diesen Schnittpräparationen zu testen.
Und so haben wir gezeigt, dass wir durch die Verwendung fluoreszierender Farbstoffe verschiedene Bereiche räumlich stimulieren können, indem wir diese fluoreszierenden Analoga in die Kanäle injizieren. Der nächste Schritt besteht nun darin, tatsächlich biologische Experimente durchzuführen. Das Fachgebiet der Mikrofluidik befindet sich somit an einem Übergangspunkt.
Wir bewegen uns fort von neuartigen Machbarkeitsnachweisen und nutzen diese Geräte nun tatsächlich, um zuvor unmögliche, neue und spannende Entdeckungen zu machen. Das Feld entwickelt sich also hinweg von Techniken, bei denen wir auf mikroskaligen Prinzipien wie schneller Diffusion, laminarer Strömung, hohen Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnissen und Prozessintegration basierten. Nun werden wir diese Prinzipien nutzen und anwenden, um unerfüllte Anforderungen im Labor und in der Klinik zu adressieren.
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Übersicht
In diesem Artikel wird die Anwendung von mikrofluidischen Vorrichtungen in der Neurowissenschaft behandelt, insbesondere für die räumlich-zeitliche Stimulation von Gehirnschnitten. Die Methode verbessert die Präzision der Neurotransmitterapplikation im Vergleich zu herkömmlichen Techniken.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Bioingenieurwesen
- Mikrofluidik
Hintergrund
- Elektrophysiologische Schnittpräparationen werden häufig in der Neurowissenschaft verwendet.
- Aktuelle Methoden der Neurotransmitterapplikation sind in ihrer Präzision begrenzt.
- Mikrofluidische Vorrichtungen bieten einen neuartigen Ansatz, um Stimulationsverfahren zu verbessern.
- Herkömmliche Perfusionskammern für Gehirnschnitte können zur Steigerung der Funktionalität angepasst werden.
Zweck der Studie
- Eine mikrofluidische Vorrichtung vorstellen, die eine räumlich-zeitliche Stimulation von Gehirnschnitten ermöglicht.
- Die Applikation von Neurotransmittern in elektrophysiologischen Studien verbessern.
- Eine besser kontrollierbare Umgebung für Experimente mit Gehirnschnitten bereitstellen.
Verwendete Methoden
- Entwicklung einer mikrofluidischen Vorrichtung, die mit Perfusionskammern für Gehirnschnitte kompatibel ist.
- Anwendung von Neurotransmittern mittels des mikrofluidischen Systems.
- Vergleich von Stimulationsmethoden: global versus lokalisiert.
- Elektrophysiologische Messungen zur Beurteilung der Wirksamkeit der Stimulation.
Hauptergebnisse
- Das mikrofluidische Gerät ermöglicht eine präzise Steuerung der Neurotransmitterzufuhr.
- Die räumlich-zeitliche Stimulation zeigt verbesserte Ergebnisse im Vergleich zu herkömmlichen Methoden.
- Verbesserte experimentelle Ergebnisse bei Hirnschnittpräparationen.
- Potenzial für weiterreichende Anwendungen in der Neurowissenschaftsforschung.
Schlussfolgerungen
- Mikrofluidische Vorrichtungen verbessern die Applikation von Neurotransmittern in Gehirnschnitten erheblich.
- Diese Technologie kann elektrophysiologische Untersuchungen und verwandte Forschungsarbeiten voranbringen.
- Zukünftige Studien könnten weitere Anwendungen dieser Methode untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Integration der Mikrofluidik mit der Elektrophysiologie adressiert ein zentrales, bisher unerfülltes Bedürfnis in der Neurowissenschaftsforschung: die räumlich und zeitlich kontrollierte Zufuhr von Neuromodulatoren zu Gehirnschnitten. Indem sie regionspezifische Stimulationsmuster ermöglicht, die in-vivo-Bedingungen besser nachahmen, verbessert die Plattform das Vorhersagevertrauen bei der Zielvalidierung und die mechanistische Entlastung von Risiken in Programmen zur Wirkstoffforschung für das zentrale Nervensystem. Das vereinfachte, passiv gepumpte Design unterstützt eine breite Anwendung in verschiedenen elektrophysiologischen Arbeitsabläufen, ohne dass spezielle Infrastruktur erforderlich ist.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch präzise räumliche Steuerung der Anwendung von Neuromodulatoren in definierten Hirnregionen.
- Operationaler Wert: Macht die Handhabung von Mikropipetten überflüssig und verringert so die technische Variabilität in Experimenten zur Neurotransmitterabgabe.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, da physiologisch relevantere Stimulationsmuster erzeugt werden können als bei globaler Perfusion.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte Gehirnschnittsysteme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening vor, indem reproduzierbare, lokalisierte Stimulationsprotokolle etabliert werden.
- Quantitative Ausgabe: Ermöglicht die Messung regionsspezifischer elektrophysiologischer Antworten und damit Dosis-Wirkungs- sowie kinetische Analysen.
- Plattform-Wiederverwendung: Kann durch Neugestaltung der mikrofluidischen Kanäle an verschiedene Hirnregionen (z. B. Hippocampus, Kortex) angepasst werden und unterstützt so Screening-Kampagnen mit mehreren Zielstrukturen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungs- und präklinische Phase, indem ein krankheitsrelevantes System bereitgestellt wird, um die Wirkung von Neuromodulatoren in strukturiertem Nervengewebe zu testen.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Klärt wegweisspezifische Arzneimittelwirkungen durch isolierte regionale Stimulation und verringert so die Uneindeutigkeit bei Target-Engagement-Studien.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem regionabhängige Wirksamkeit und Off-Target-Signale früh im Entdeckungsprozess sichtbar werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung bis zur präklinischen Bewertung und ermöglicht räumlich aufgelöste mechanistische Untersuchungen, die das Vertrauen in die Auswahl von ZNS-Targets und die Optimierung von Leitverbindungen erhöhen.
- Entdeckungsbasierte Biologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen, indem sie die Isolierung unabhängiger Variablen (z. B. regionale Exposition gegenüber Neuromodulatoren) in komplexen neuronalen Präparationen ermöglicht.
- Screening: Verbessert die Reproduzierbarkeit von Assays und quantitative Auswertungen durch standardisierte, passiv pumpengetriebene Flüssigkeitszufuhr über mikrofluidische Kanäle.
- Analytik: Erzeugt bedingungsspezifische elektrophysiologische Messungen, die es Teams ermöglichen, regionale Antworten zu vergleichen und Wirksamkeit sowie Selektivität von Stimulanzien zu bewerten.
- Translationale Forschung: Schafft einen Bezug zur präklinischen Kontinuität, indem Gehirnschnitte als krankheitsrelevante Systeme zur Bewertung der Wirkung von Neuromodulatoren in erhaltener Gewebearchitektur verwendet werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Als wiederverwendbare Plattform konzipiert, die mit standardmäßigen Perfusionskammern kompatibel ist und so den Bedarf an erneuter Validierung zwischen Laboren und Projekten minimiert.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unschärfen durch räumlich kontrollierte Stimulation verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch passives Pumpen und eliminiert die Abhängigkeit von externen Pumpen oder komplexen Schläuchen.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem multiplexierte regionale Tests in einem einzigen elektrophysiologischen Aufbau ermöglicht werden, wodurch eine Verdopplung von Assays reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem klarere Struktur-Wirkungs-Beziehungen und Target-Bindungsdaten über verschiedene Hirnsubregionen hinweg bereitgestellt werden.
Durchlegungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit mikrofluidischen Vorrichtungen und der Integration in elektrophysiologische Versuchsaufbauten.
- Hängt vom Zugang zu standardmäßigen Perfusionskammern für Gehirnschnitte und mikroskopischen Abbildungssystemen ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um eine konsistente Andockung der Vorrichtungen und Ausrichtung der Kanäle zwischen verschiedenen Nutzern zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Zielregion im Gehirn, die durch Neugestaltung der Durchkontaktierungen und Kanalstrukturen in der mikrofluidischen Vorrichtung erfolgen.
- Ist durch die Notwendigkeit fluoreszenter oder elektrophysiologischer Validierung eingeschränkt, um eine erfolgreiche Zufuhr von Neuromodulatoren zu den Zielregionen zu bestätigen.
