Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein in vivo menschliches Gefäßnetzwerk zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst aus menschlichem Blut stammende endotheliale Kolonie-bildende Zellen und aus menschlichem Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen kultiviert werden. Anschließend werden beide Zelltypen in ein Kollagen-basiertes Gel gemischt, das subkutan in eine immundefiziente Maus injiziert wird.

Sieben Tage später wird das Implantat entnommen und auf die Bildung eines menschlichen vaskulären Netzwerks untersucht. Letztendlich kann das Vorhandensein menschenspezifischer Mikrogefäße innerhalb der Implantate durch histologische und immunhistochemische Verfahren nachgewiesen werden. Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber einer Methode wie der chirurgischen Implantation eines Konstrukts ist LED, da sie einfach und leicht durchzuführen ist und keinen chirurgischen Eingriff erfordert.

Beginnen Sie damit, eine Vial mit E CFCs aufzutauen, und verdünnen Sie die Zellen unverzüglich in einem 15-Milliliter-Kegelrohr, das 10 Milliliter DMEM enthält. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 1200 U/min für fünf Minuten und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter warmem EGM-2-Medium. Überführen Sie die Zellen anschließend in eine mit 1 % Gelatine beschichtete 100-Millimeter-Zellkulturplatte und inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem befeuchteten Inkubator.

Am folgenden Morgen das Medium und alle nicht gebundenen Zellen vorsichtig abpipettieren. Anschließend die gebundenen Zellen mit 10 Milliliter frischem E GM zwei Medium versorgen. Diesen Vorgang in den nächsten Tagen fortsetzen, bis sich eine konfluente Zellschicht gebildet hat.

Waschen Sie die Zellen anschließend mit 10 Milliliter PBS. Ersetzen Sie den PBS durch zwei Milliliter Trypsin-EDTA und stellen Sie die Platte für fünf Minuten in den Inkubator. Überprüfen Sie nach fünf Minuten unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen gelöst haben, indem Sie vorsichtig auf die Platte klopfen.

Falls dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie die kurzen Inkubationen mit sanftem Schwenken. Sobald die Zellen vollständig abgelöst sind, geben Sie acht Milliliter EGM zwei Medium zu den Zellen hinzu und überführen die Zellen in ein 15-Milliliter-Kegelgefäß. Zählen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang mit 1200 U/min.

Plattieren Sie die Zellen nun auf mit 1 % Gelatine beschichteten Zellkulturschalen mit einer Ansiedlungsdichte von 5.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Inkubieren Sie die Zellen in EGM-2-Medium und versorgen Sie sie alle zwei bis drei Tage mit frischem EGM-2-Medium. Wiederholen Sie dieses Verfahren für nachfolgende Passagen zwischen der vierten und achten Passage.

Die E CFCs sind gebrauchsfertig. Dieses Protokoll kann auch zum Kultivieren von MSCs verwendet werden. Ersetzen Sie dazu das E GM zwei Medium durch M-S-C-G-M Medium.

Verwenden Sie eine nicht beschichtete Kulturplatte. Beginnen Sie die Subkultur bei 80 % Konfluenz und subkultivieren Sie mit einer Aussaatdichte von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Für dieses Experiment werden 800.000 E CFCs und 1.200.000 MSCs pro Implantat benötigt.

Im Allgemeinen werden fünf Implantate gleichzeitig vorbereitet. Beginnen Sie damit, das Zellmedium von den Kulturplatten abzusaugen und spülen Sie jede Zellplatte mit 10 Milliliter PBS. Ersetzen Sie das PBS durch zwei Milliliter Trypsin-EDTA und inkubieren Sie die Platten mit sanftem Schütteln.

Überprüfen Sie die Zellen alle zwei bis fünf Minuten unter dem Mikroskop, bis sich alle Zellen gelöst haben. Geben Sie dann acht Milliliter DMEM hinzu und sammeln Sie die Zelllösung. Zählen Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Kegelrohr und überführen Sie ausreichend Zellen für fünf Implantate in ein einzelnes 15-Milliliter-Kegelrohr.

Anschließend die Zellen bei 1200 U/min fünf Minuten lang abzentrifugieren und das Überstand entfernen. Vorsichtig eine Mischung aus Fibrinogen und Kollagen-Fibronectin auf Eis herstellen. Danach das Zellpellet vorsichtig in der eiskalten Mischung resuspendieren.

Unter Vermeidung von Luftblasen wird die Zellsuspension in eine Ein-Milliliter-Spritze gefüllt und eine verschlossene 26-Gauge-Nadel angebracht. Die beladene Spritze wird bis zur Injektion der Zellmischung auf Eis gehalten. Vier sechs Wochen alte athymische, nackt, immundefiziente Mäuse werden mittels einer ISO-Fluorin-Kammer anästhesiert.

Nachdem die Mäuse anästhesiert sind und nicht mehr auf eine Zehenquetschung reagieren, fahren Sie mit den Injektionen für jede Maus fort. Injizieren Sie mit einer 30-Gauge-Nadel 50 µL Thrombin-Lösung subkutan in den oberen dorsalen Bereich. An derselben Stelle injizieren Sie 200 µL der Zellmischung.

Mit einer 26-Gauge-Nadel injizierte Makromoleküle verquellen und bilden unter der Haut eine kleine, aber deutlich sichtbare Erhebung. Nach der Injektion die Mäuse zur Bequemlichkeit und Wärme auf eine Mullkompresse legen. Sie beobachten, bis sie wieder lauffähig sind.

Beobachten Sie in den nächsten drei Tagen täglich die allgemeine Gesundheit der Tiere. Eine Woche nach den Injektionen werden die Mäuse mit Kohlendioxid euthanasiert und der Gel-Plug operativ entfernt. Nach der Entnahme werden die Gel-Plugs zusammen mit einem Lineal fotografiert, anschließend jeder Gel-Plug in eine histologische Kassette gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur in 10 % neutral gepuffertem Formalin eingelagert.

Am nächsten Tag das 10 %ige neutral gepufferte Formalin mit destilliertem Wasser abwaschen. Die Kassetten bis zur histologischen Auswertung bei vier Grad Celsius in PBS lagern. Stellen Sie sieben Mikrometer dicke Schnitte des in Paraffin eingebetteten Implantats her.

Anschließend quantifizieren Sie die Dichte der Mikrogefäße im mittleren Bereich der Implantate. Mithilfe einer H-und-e-Färbung bewerten Sie die Anzahl der Gefäße pro Quadratmillimeter, um den humanen Charakter der mikrovaskulären Gefäße nachzuweisen. Färben Sie die Schnitte mit einem kommerziell erhältlichen anti-humanen CD31-Antikörper in einer Verdünnung von 1 zu 100.

Dieses Phasenkontrastbild zeigt die charakteristische kieselsteinartige Morphologie von endothelialen Zellen in einer typischen konfluenten Monoschicht von aus Nabelschnurblut gewonnenen eCFCs. Dieses Bild zeigt die typische spindelförmige Morphologie von aus menschlichem Knochenmark gewonnenen MSCs. Nach einer einwöchigen Inkubation im Mauswirt sah das durch eine gelbe gestrichelte Linie markierte Implantat bei höherer Vergrößerung ganz anders aus als das Gewebe des Wirts.

Mehrere Mikrogefäße zeigten ihre luminalen Strukturen, die rote Blutkörperchen enthielten, und sind durch die gelben Pfeilspitzen hervorgehoben. Bei immunhistochemischer Untersuchung der Plugs reagierten die Lumina der Mikrogefäße auf einen monoklonalen Antikörper gegen menschliches CD31. Die Zellkerne wurden mit Hämatin kontrastgefärbt.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie innerhalb einer Unze durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.