A. mesenterica Kontraktion und Entspannung Studies Verwendung automatisierter Draht Myographie

Dieses Verfahren verwendet salzempfindliche und salzresistente Ratten, um die Reaktivität der mesenterialen Widerstandsarterien unter Phenylephrin-induzierter Spannung gegenüber extrazellulärem Kalzium zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die mesenteriale Arkade von den Tieren isoliert und die Widerstandsarterienäste präpariert werden. Anschließend wird ein erster von zwei Edelstahldrähten durch ein kurzes Segment der präparierten Arterie geführt, und das Gefäß wird in die Myographenkammer montiert.

Dann wird der zweite Edelstahldraht parallel zum ersten Draht durch das Lumens des Gefäßes geführt. Anschließend wird das befestigte Gefäß auf einen normalisierten inneren Umfang gedehnt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das Gefäß erneut zu aktivieren, indem es wiederholt mit Phenylephrin herausgefordert und anschließend mit aufsteigenden Gaben von Calcium entspannt wird.

Letztlich zeigen die Ergebnisse Veränderungen der Spannung im Gefäß, die in eine Kalzium-Antwortkurve umgewandelt und zur Bestimmung der EC 50-Werte verwendet werden können. Zum Vergleich. Uns kam die Idee, diese Methode anzuwenden, als wir entdeckten, dass das Nev-Netzwerk von Ratten-Masonary-Batterien einen Gpro-Kupfer-Kalzium-Sens-Rezeptor exprimierte.

Das kann auf die gleiche Weise untersucht werden wie die bitteren AIC-Rezeptoren, die durch einen Agonisten aktiviert werden. Personen, die mit dieser Methode neu sind, haben in der Regel Schwierigkeiten, da die Endothel- und Muskelzellschicht gering ist. Die Gefäße lassen sich leicht beschädigen.

Wenn dies eintritt, können die mechanischen Eigenschaften dieser Gefäße beeinträchtigt sein. Bereiten Sie zunächst den Arbeitsbereich und die chirurgischen Instrumente vor. Legen Sie ein anästhesiertes Tier auf den Rücken und wischen Sie den Bauch mit Alkohol ab.

Nach Durchführung einer medianen Laparotomie etwa 85 Zentimeter Dünndarm einschließlich der Arteria mesenterica superior mit der Schere entfernen. Den proximalen Stumpf nahe der Pylorusgegend und den distalen Stumpf in der Nähe der Ileozäkumregion durchtrennen. Den ausgeschnittenen Abschnitt in eine beschichtete Petrischale mit physiologischer Salzlösung oder PSS bei Raumtemperatur legen.

Fixieren Sie das proximale Ende des Darms rechts und heften Sie anschließend den restlichen Darm im Gegenuhrzeigersinn fest. Danach diszieren Sie einen Abschnitt der mesenterischen Arterie, der die Zweige zwei und drei sowie ein Stück des Darms vom proximalen Ende enthält. Identifizieren Sie den V-förmigen Verzweigungspunkt der mesenterischen Arterie und lösen Sie ihn von der Vene ab.

Verwenden Sie eine Pinzette, um Fett- und Bindegewebe vorsichtig zu entfernen, um direkten Kontakt mit der Arterie zu vermeiden. Zum Beginn der Montage des Gefäßes schneiden Sie zwei Arteriensegmente von etwa zwei Millimetern Länge ab. Die Spitze eines vier Zentimeter langen, 40 Mikrometer dicken, wolframfreien Edelstahldrahts kann verwendet werden, um das Lumen der Arterie zu öffnen.

Verwenden Sie dann feine Pinzette, um den Draht in das Lumen jeder Arterie einzuführen. Füllen Sie die Myograff-Kammer unter Schonung des Endothels mit PSS auf 37 Grad Celsius. Übertragen Sie das präparierte Gefäßsegment mit der Pinzette in die Kammer.

Überführen Sie als Nächstes das ausgeschnittene proximale Gefäßsegment in die Myographenkammer und ziehen Sie das Ende entlang des Drahtes, um es in das Gefäß einzuführen. Vermeiden Sie es, das Gefäß zu dehnen. Sichern Sie das nahe Ende des Drahtes gegen den Uhrzeigersinn unter der vorderen Befestigungsschraube an der rechten Backe, die mit dem Mikrometer verbunden ist.

Fassen Sie das freie Ende des Drahtes mit einer Pinzette und befestigen Sie ihn im Uhrzeigersinn unter der hinteren Befestigungsschraube am rechten Backenende. Achten Sie darauf, dass das Gefäßsegment entlang des Drahtes im Spalt zwischen den Backen liegt, ohne die Backen selbst zu berühren. Drehen Sie die Backen auseinander. Richten Sie den zweiten Draht parallel zum Gefäß aus und führen Sie ihn in das entfernte Ende des Lumens ein.

Führen Sie den Draht vorsichtig in einer Bewegung durch das Lumen des Gefäßabschnitts, wobei Sie den bereits befestigten Draht als Führungsstrang verwenden. Halten Sie den Draht etwa einen Zentimeter vom Gefäß entfernt, um eine Dehnung während des Vorgangs zu vermeiden, und berühren Sie nicht das Endothel. Schrauben Sie die Backen zusammen und stellen Sie sicher, dass sich der zweite Montagedraht unterhalb des bereits auf der rechten Seite befestigten ersten Drahts bewegt.

Spannungsfutter: Sichern Sie das nahe Ende des zweiten Drahtes im Uhrzeigersinn unter der vorderen Befestigungsschraube des linken Spannungsfutters, das mit dem Wandler verbunden ist. Sichern Sie das ferne Ende des Drahtes unter der Befestigungsschraube am linken Spannungsfutter und ziehen Sie es fest, um den Draht zu dehnen. Sobald die Montage abgeschlossen ist, lassen Sie 30 Minuten zur Equilibrierung bei 37 Grad Celsius zu.

Nach der Equilibrierung wird der Motor über das Montagemenü zurückgesetzt, und das Normalisierungsverfahren, bei dem das Gefäß auf einen normalisierten inneren Umfang gedehnt wird, wird eingeleitet. Öffnen Sie zunächst das Normalisierungsmenü und stellen Sie den Ziel-Transmuraldruck auf 13,3 Kilopascal ein. Stellen Sie danach die Dauer jedes Normalisierungsschritts auf 60 Sekunden ein.

Das Verhältnis von IC eins zu IC 100 sollte 0,9 betragen, und die IP-Kalibrierung sollte auf zwei Stern-Delta eingestellt werden. Messen Sie die Länge der montierten Mesenterialarterie mithilfe der Ablesungen im Mikroskopeyepiece, wenn die Fadenkreuze über den äußeren Enden des Gefäßsegments liegen. Nach der Normalisierung werden die Gefäße durch eine Standardstarreaktivierung reaktiviert, die aus einer Abfolge von Stimulations- und Spülphasen besteht.

Ersetzen Sie zunächst den Myo-Kammerdeckel und beginnen Sie die Belüftung mit 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid. Füllen Sie die Kammer mit frischem PSS, das 100 Mikromolar Ascorbinsäure enthält. Kontrahieren Sie das Gefäß mit fünf Mikromolar Fennel, Rine oder PE für fünf Minuten und waschen Sie viermal mit PSS-Puffer. Nach der letzten Wäsche füllen Sie die Kammer erneut mit PSS und warten drei Minuten, bevor Sie die Kammer erneut mit PSS auffüllen und mit PE kontrahieren. Wie zuvor gezeigt, ist die Arterie nun bereit für das Experiment.

Messen Sie die Relaxation kontrahierter Gefäße durch sukzessive Zugabe steigender Konzentrationen von Calciumchlorid. Diese Tabelle zeigt, dass die basalen Spannungen nach der Applikation von Phenylephrin zwischen Wistar-DS- oder Doll-Salz-sensitiven und DR- oder Doll-Salz-resistenten Ratten variierten. Diese Aufzeichnung von einer Wistar-Ratte zeigt die Relaxation von mit PE kontrahierten Arterien durch kumulative Zugaben von Calcium; die Relaxation ist bei Gewebeproben von DS-Ratten im Vergleich zu Wistar-Ratten sowie im Vergleich zu DR-Ratten erheblich beeinträchtigt. Wie hier zu sehen, lassen sich die Unterschiede in der Calciumsensitivität in den Calcium-Antwortkurven erkennen, und erneut bei der Berechnung der EC50-Werte.

Schließlich zeigen DS-Ratten im Vergleich zu Dr.-Ratten einmal beherrscht eine Verringerung der Expression des Kalzium-Sensor-Rezeptors in den Arterien. Diese Technik kann bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die vaskuläre Reaktivität kleiner mesenterischer Arterien gegenüber exogenen Verbindungen unter isometrischen Bedingungen vergleicht.