Beurteilung Myogenic Antwort und Vasoaktivität In Resistance Mesenterialarterien Mit Druck Myographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirkung eines pharmakologischen Wirkstoffs oder Krankheitszustands auf den druckinduzierten Gefäßtonus in kleinen Widerstandsmesenterialarterien zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst die mesenteriale Arkade von einem Mausmodell isoliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, die kleinen Widerstandsarterien vierter Ordnung zu präparieren.

Die nächsten Schritte sind die Kanülierung, die Druckbeaufschlagung und die Inkubation der arteriellen Präparation. Bei der PSS besteht der letzte Schritt darin, die physiologische Integrität des arteriellen Präparats zu beurteilen, was sich in der spontanen Entwicklung des Gefäßtonus und einer angemessenen reversiblen Reaktion auf einen Vasokonstriktor und einen Vasodilatator zeigt. Letztendlich kann eine druckinduzierte Verengung gemessen werden.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie oder Diagnose von Bluthochdruck, Hypotonie oder vaskulärer Dysfunktion. Denn diese Technik identifiziert Schlüsselmechanismen, die den druckinduzierten Veränderungen des Gefäßtonus zugrunde liegen, der eine Schlüsseldeterminante für den Gefäßwiderstand, die Durchblutung und den Blutdruck ist. Dieses Verfahren wird von Dr. Jja demonstriert, der als Postdoktorand in unserem Labor tätig ist.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie eine Glaskanüle in einen Mikropipettenhalter einlegen und den Mikropipettenhalter an einer Perfusionskammer befestigen, um die Perfusionskammer vorzubereiten. Spülen Sie es mit Milli Q Wasser ab, gefolgt von einer Sezierlösung für jeweils fünf Minuten. Befüllen Sie dann die Kammer mit zwei Millilitern Sezierlösung.

Füllen Sie anschließend vorsichtig die gesamte Kanüle und den beigefügten Schlauch, ohne dass Blasen entstehen. Bereiten Sie zwei Nähte mit jeweils einem halben Knoten mit einer stumpfen Pinzette unter dem Präpariermikroskop vor. Verwenden Sie eine Präparierzange, um beide Kanülen mit teilweise geschlossenen Nahtknoten leicht von der Spitze entfernt zu belasten.

Führen Sie als Nächstes eine Mittellinien-Laparotomie an einer anästhesierten Ratte vom Becken bis zum Brustbein durch, indem Sie zuerst einen Schnitt in die Haut machen und anschließend einen Schnitt in die darunter liegende Muskelschicht machen. Es muss darauf geachtet werden, dass die intraabdominalen Organe nicht verletzt werden. Binden Sie beide Enden separat zusammen, um ein Auslaufen von Glockenspiel und Kot zu verhindern und eine Kontamination der extrazellulären Badelösung zu vermeiden.

Schneiden Sie anschließend das proximale Ende des Darms in der Nähe der Pori und das distale Ende in der Nähe des ileozökalen Übergangs. Machen Sie dann einen Schnitt am Mesentar an seiner Basis in der Nähe des zuführenden Gefäßsystems. Als nächstes wird das gesamte Mesenterialbett des Dünndarms in ein 50-Milliliter-Becherglas mit eiskalter Dissektionslösung überführt und fünf Minuten lang inkubiert.

Spülen Sie es dann mit frischer Sezierlösung ab, um das Blut zu entfernen. Stecken Sie nun das proximale Ende des Darms auf der rechten Seite in eine mit Sarde beschichtete Schale, strecken Sie den restlichen Darm gegen den Uhrzeigersinn aus. Fixieren des Segments nach unten, um das Mesentar zu spreizen und die Blutgefäße unter einem Stereo-Zoom-Mikroskop freizulegen.

Präparieren Sie die kleinen Mesenterialarterien dritter und vierter Ordnung parallel zum Dünndarm, indem Sie zuerst das gesamte Deckfett in der Nähe des Astes zweiter Ordnung entfernen. Präparieren Sie dann die Vene und isolieren Sie die Arterie mit einer V-förmigen Astspitze. Achten Sie darauf, das ausgewählte Segment nicht zu durchstechen.

Als nächstes isolieren Sie einen vier bis fünf Millimeter großen Abschnitt der Arterie, der parallel zum Dünndarm verläuft. Schneiden Sie alle Äste fünfter Ordnung, die in den Dünndarm eingebettet sind, etwas weg vom Ursprung der Äste ab und bewahren Sie einen Teil auf. Diese Teile werden als Haltestellen für den Transfer von arteriellen Segmenten in eine Perfusionskammer dienen und anschließend deren Kanülierung leiten.

Schneiden Sie dann die arteriellen Segmente ab, indem Sie auf jeder Seite der Arterie zwei Schnitte distal zu den Ästen fünfter Ordnung vornehmen und in die Perfusionskammer übertragen. Kanülieren Sie ein Ende der Gefäße mit einer Mikropipette aus Glas, indem Sie die Spitze des arteriellen Segments mit einer Dissektionszange festhalten. Schieben Sie das zuvor geladene, teilweise geschlossene Nahtmaterial auf das kanülierte Ende und sichern Sie es.

Befestigen Sie anschließend eine mit Separierlösung beladene 10-Milliliter-Spritze an den Absperrhahn, der mit dieser Kanüle verbunden ist. Heben Sie die Spritze vorsichtig an. Die Schwerkraft auf die Lösung entfernt das intravaskuläre Blut aus dem offenen Ende des Gefäßes.

Nach der Entnahme des intraarteriellen Blutes schließen Sie den Absperrhahn. Binden Sie nun das distale Ende der Gefäße an eine zweite Glaskanüle, indem Sie die andere Kanüle vorsichtig so nah wie möglich an das gelöste Ende des arteriellen Segments heranführen. Schieben Sie das zuvor belastete, teilweise geschlossene Naht auf das kanülierte Ende und sichern Sie es.

Es muss darauf geachtet werden, nicht an den arteriellen Segmenten zu ziehen oder zu ziehen, und es ist darauf zu achten, dass der an beiden Kanülen befestigte Stop Cox geschlossen ist. Übertragen Sie die Perfusionskammer auf den Tisch des inversen Mikroskops, das mit Live-Videoaufzeichnung ausgestattet ist. Verbinden Sie dann den Absperrhahn der Kanüle, der an das proximale Ende des arteriellen Segments gebunden ist, mit einer servogesteuerten Druckregelvorrichtung.

Stellen Sie sicher, dass der an der anderen Kanüle befestigte Absperrhahn geschlossen bleibt, um einen stabilen intraluminalen Druck aufrechtzuerhalten. Befestigen Sie als Nächstes den Vakuumschlauch an den Perfusionsschlauch und die Saugöffnung an die Perfusionsöffnung der Kammer. Beginnen Sie mit der Perfusion des Gefäßes mit warmem PSS durch den einzelnen Inline-Lösungserhitzer bei zwei Millilitern pro Minute.

Schalten Sie mit einer Schlauchpumpe das Vakuum ein, da die Temperatur von PSS in der Kammer nahe 37 Grad Celsius liegt. Erhöhen Sie langsam den intraluminalen Druck von 20 auf 100 Millimeter Quecksilbersäule. Überprüfen Sie den Behälter mit der automatischen Druckeinstellung des Druckreglers auf Undichtigkeiten.

Beurteilen Sie danach das arterielle Segment auf Biegungen, während Sie den Druck bei 100 Millimeter Quecksilbersäule halten. Bewegen Sie die Kanüle mit dem Schraubhebel, um das arterielle Segment zu begradigen und die arteriellen Segmente nicht zu überdehnen. Reduzieren Sie dann den Druck auf 70 Millimeter Quecksilbersäule, um den In-vivo-Druck in der mesenterialen Arkade nachzuahmen, und lassen Sie das arterielle Segment sich stabilisieren und einen myogenen Tonus entwickeln.

Betrachten Sie bei diesem Verfahren die Arterie mit einem 10-fach-Objektiv unter einem Mikroskop, das mit einer monochromen Videoladung ausgestattet ist. Koppeln Sie die Gerätekamera. Messen Sie den luminalen Durchmesser mit einem Video-Framegrabber und einem Echtzeit-Kantenerkennungssystem.

Erfassen Sie dann den Gefäßdurchmesser und überwachen Sie die Entwicklung des myogenen Tonus. Reduzieren Sie danach den Druck auf 20 Millimeter Quecksilbersäule und lassen Sie den Durchmesser stabilisieren. Erhöhen Sie dann den intraluminalen Druck in inkrementellen Schritten wie 20, 40, 60, 80 und 100 und lassen Sie die Arterie bei jedem Druck einen stabilen Durchmesser erreichen.

Wiederholen Sie im nächsten Schritt die Druckschrittantwort in kalziumfreiem PSS, das 0,39 millimolare EGTA und 0,1 millimolare Natriumnitropress enthält, wie durch die Abtastung angezeigt, der Durchmesser der kleinen mesenterialen Arterien von Ratten nimmt spontan ab, wenn er bei 70 Millimeter Quecksilbersäule unter Druck gesetzt wird, die Zugabe von einem mikromolaren Acetylcholin vergrößerte den Durchmesser auf den nahen Ausgangsdurchmesser. Die Zugabe von einem mikromolaren Phenylephrin zum Gewebebad verringerte den arteriellen Durchmesser, und diese Abbildung zeigt, dass die Inkubation der kleinen mesenterialen Arterien in calciumfreiem PSS den arteriellen Durchmesser erhöht. Der Durchmesser eines einzelnen druckbeaufschlagten arteriellen Segments in verschiedenen Perfundachten ist in dieser Tabelle dargestellt.

Hier wird der arterielle Durchmesser kontinuierlich aufgezeichnet, während der intraluminale Druck in Gegenwart von PSS und calciumfreiem PSS schrittweise ansteigt. Hier sind die Kurven des arteriellen Durchmessers, der bei jedem Druckschritt erreicht wird, und das Balkendiagramm des myogenen Tonus, der bei jedem Druckschritt erreicht wird, ist hier Off dargestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das myogene Verhalten kleiner Resistenzarterien beurteilt.

Mit dieser Technik können Sie zusätzliche Eingriffe wie Endothelaufschluss und arterielle Permeation durchführen. Beide Verfahren können weitere Fragen zur Rolle von Endothel und Calcium bei der Regulation des Gefäßtonus kleiner Widerstandsarterien beantworten.