Non-Laser Capture Microscopy Ansatz für die Mikrodissektion von Discrete-Maus Hirnregionen für Gesamt-RNA Isolierung und Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling
13. November 2011
Die Profilierung der RNA-Expression in diskreten Regionen des Mausgehirns erfordert eine präzise und reproduzierbare Strategie zur Gewinnung von Gewebeproben. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das sowohl die koronare Schnittführung des Gehirns als auch die mikrodissektionsbasierte Gewebeentnahme mithilfe eines Gewebecorers nutzt. Die Ausbeute und Qualität der gesamten RNA aus den resultierenden Proben bestätigt die Eignung der dargestellten Methode.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Gesamt-RNA aus einzelnen Hirnkernen auf wiederholbare, konsistente, kosteneffiziente und RNasenfreie Weise zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine RNasenfreie Arbeitsumgebung vorbereitet und das gesamte Gehirn von einem dekapitierten Maus entnommen wird. Anschließend wird mit einem mikrometergesteuerten Gewebeschneider eine Serie gleichmäßig großer Gewebeschnitte angefertigt.
Anschließend werden die gewünschten Hirnregionen mittels eines Gewebekerns mit festgelegtem Durchmesser mikrodisseziert, wobei das Gewebe in einer RNA-freien Umgebung gehalten wird. Schließlich wird die gesamte RNA aus den ausgeschnittenen Hirnkernen isoliert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine ausreichende Ausbeute und Qualität an Gesamt-RNA für die nachfolgende cDNA-Bibliotheksherstellung und die Transkriptom-Profilierung mittels spektralphotometrischer oder fluorimetrischer Assays zeigen.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der grobanatomischen oder der laserunterstützten Mikrodissektion zur Entnahme von Gehirnarealen besteht darin, dass mehrere diskrete Zielregionen des Gehirns von einem einzelnen Maushirn auf wiederholbare und kosteneffiziente Weise gewonnen werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise, ob unterschiedliche Transkriptexpressionsprofile in Gehirnarealen, die mit nicht-neuronalen Netzwerken assoziiert sind, mit bestimmten Verhaltensmerkmalen, Umweltreaktionen und/oder Krankheitszuständen korrelieren. Zur Vorbereitung der Mikrodissektion 100 Milliliter Earl’schen Balanced Salt Solution (EBSS) mit 0,44 Gramm Natriumbikarbonat und 0,884 Gramm Glukose versetzen.
Behandeln Sie das EBSS mit 0,1 Milliliter DEPC in einer autoklavierbaren Flasche oder einem Kolben mit Schraubverschluss mindestens 12 Stunden lang. Bei 37 Grad Celsius. Geben Sie Glasspipetten mit einer Länge von fünf¾ Zoll in einen einliterigen Glasbecher und stellen Sie Pinsel mit den Borsten nach oben in einen 100-Milliliter-Glaszylinder mit Eichstrichen.
Fügen Sie ausreichend DEPC-behandelte Wasserlösung hinzu, um die Pipetten und Bürsten zu bedecken. Bedecken Sie das Becherglas und den Messzylinder mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie mindestens 12 Stunden bei 37 Grad Celsius. Nach der 12-stündigen Inkubation mit DEPC erhitzen Sie alle mit DEPC behandelten Materialien auf eine Temperatur über 100 Grad Celsius für mindestens 15 Minuten. Kühlen Sie ab. Das EBSS vor der Lagerung bei Raumtemperatur auf vier Grad Celsius.
Geben Sie das DD H2O aus dem Becher und dem Messzylinder ab und inkubieren Sie diese weiter bei über 100 Grad Celsius, bis die Materialien trocken sind. Entnehmen Sie sie dem Inkubator, kühlen Sie sie auf Raumtemperatur ab und bewahren Sie sie für die spätere Verwendung auf. Am Tag des Experiments behandeln Sie alle Arbeitsflächen, um RNase-Kontaminationen zu entfernen, und stellen Sie das EBSS in ein Wasserbad, das auf 40 Grad Celsius eingestellt ist, um es zu puffern und zu oxygenieren.
Das EBSS wird mit 5 % CO2 und 95 % Sauerstoff durchgeführt, indem ein Gasschlauch in eine RNA-freie Pasteur-Pipette eingeführt wird. Anschließend wird die Pipette in das EBSS eingeführt und die Öffnung des EBSS-Behälters abgedeckt. Richten Sie einen Gewebeschneider für die Serienschnittpräparation des Hirngewebes ein.
Behandeln Sie die oberen und unteren Flächen des Gewebeschneiders. Um RNA-Kontaminationen zu entfernen, befestigen Sie ein rechteckiges Stück Watman Nummer vier Filterpapier an der Plexiglasfläche des Gewebeschneiders. Befestigen Sie eine Doppelschneidenschneide an dem Schneidearm.
Stellen Sie den Messschieber auf Null und justieren Sie die minimale Höhe des Schneidearms, sodass die Rasierklinge das Filterpapier, nicht jedoch die Plexiglasscheibe durchtrennen kann. Sammeln Sie alle weiteren Materialien, die für die Mikrodissektion benötigt werden, einschließlich RNA-freier Zellkulturschalen mit den Maßen 60 mal 15 Millimeter, 200-Mikroliter-RNA-freier Mikropipettenspitzen, gebogener Schere, Trockeneis und Röhrchen für die Gewebesammlung. Stellen Sie die Röhrchen auf Trockeneis, nachdem Sie eine Maus mit einer Nagetier-Garrotte enthauptet und das gesamte Gehirn einschließlich des Hinterhirns und der Sehnerven intakt entfernt haben.
Legen Sie das Gehirn in die obere Hälfte einer RNase-freien Zellkulturschale mit den Maßen 60 mal 15 Millimeter. Überführen Sie es anschließend auf die Arbeitsfläche für die Gewebeprobenentnahme. Befeuchten Sie vorsichtig das am Gewebeschneider befestigte Filterpapier mit EBSS, indem Sie eine RNase-freie Pipette verwenden.
Befeuchten Sie das Hirngewebe mit EBSS. Überführen Sie das Gehirn in den Gewebeschneider und positionieren Sie es so, dass die ventrale Fläche auf dem Filterpapier aufliegt. Die Mittellinie steht dabei senkrecht zur Schneidklinge, und die rostrale Kante des Gehirns berührt die Klinge.
Verwenden Sie einen mit A-D-E-P-C behandelten Pinsel, um das Gehirn stationär zu halten, indem Sie sanften Druck auf die dorsale Oberfläche des Gehirns ausüben, während Sie das Gehirn fixiert halten. Heben Sie den Klingenträgerhebel etwa vier bis fünf Zentimeter über die dorsale Gewebsoberfläche an und halten Sie ihn in dieser Position. Entfernen Sie den Pinsel von der Gehirnoberfläche und stellen Sie 750 Mikrometer ein.
Verwendung des Mikrometers. Lassen Sie den Hebel absinken, wodurch das Gewebe durchtrennt wird und ein 750 Mikrometer dicker koronaler Schnitt entsteht, während die Schneidklinge stationär bleibt. Benutzen Sie eine rollende Bewegung mit dem Pinsel des Künstlers, um den Gewebeschnitt vorsichtig von der Oberfläche der Klinge wegzustreichen.
Legen Sie den Gewebeschnitt sofort in das oxygenierte EBSS in die Petrischale. Dieser Schnitt ist nun bereit für die Mikrodissektion. Wiederholen Sie den Schneidevorgang, bis serielle Gehirnschnitte über die gesamte rostrokaudale Ebene erhalten wurden, um die Mikrodissektion durchzuführen.
Zunächst die Beleuchtung überprüfen, um sicherzustellen, dass die Probenausleuchtung nicht behindert wird. Die Position und der Fluss der O2-CO2-Mischung so einstellen, dass ein gepuffertes, mit Sauerstoff angereichertes Milieu für das Gewebe erhalten bleibt. Während des Verfahrens den koronalen Gehirnschnitt identifizieren, der den Bereich von Interesse enthält, und mithilfe eines Pinsels das Gewebe flach auf dem Boden der Petrischale ausrichten.
Wählen Sie den Gewebekern mit dem geeigneten Durchmesser aus. Halten Sie den koronalen Gewebeschnitt mit dem Pinsel fest und führen Sie die Schneidspitze des Gewebekerns über die Oberfläche des Gewebeschnitts. Üben Sie Druck aus, indem Sie die Spitze des Gewebekerns durch den Gewebeschnitt hindurch fest auf den Boden der Petrischale drücken.
Verwenden Sie eine rollende kreisförmige Bewegung, um sicherzustellen, dass der Bereich von Interesse vom umgebenden Gewebe abgelöst wurde. Heben Sie den Gewebekern vorsichtig von dem Gewebeschnitt ab und lösen Sie die Mikrobiopsie, sodass sie im EBSS mit einem Künstlerpinsel schwimmt. Geben Sie die Gewebemikrobiopsie unverzüglich in ein bei Trockeneis aufbewahrtes Lagertube mit einer Temperatur von minus 80 Grad Celsius.
Das Gewebe sollte leicht an der Seite des Röhrchens haften. Stellen Sie das Mikroproben enthaltende Röhrchen zurück auf Trockeneis. Wiederholen Sie diese Mikrodissektion für jede interessierende Hirnregion.
Wenn die Mikrodissektion abgeschlossen ist, notieren Sie die jeweiligen Etiketten oder Barcodes für jeden Reagenzglasinhalt. Stellen Sie die Gewebeproben bis zur RNA-Extraktion in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius, um RNA aus den Gewebeproben zu gewinnen. Bereiten Sie zunächst einen RNA-freien Arbeitsbereich vor.
Stellen Sie eine ausreichende Menge an Magnetperlen-Mix und Lyse-Bindungs-Lösung gemäß der Anleitung des Gesamt-RNA-Isolationskits her. Entnehmen Sie die Gewebeproben dem minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank und stellen Sie die Röhrchen direkt auf Trockeneis. Geben Sie 100 µL der Lyse-Bindungs-Lösung in ein Röhrchen mit Probe.
Befestigen Sie einen nukleasefreien Stößel der Größe 0,5 Milliliter an dem Pelletmischer und homogenisieren Sie das Gewebe mit einer pipettenspitze mit geringer Retention, die nukleasefrei ist. Überführen Sie die homogenisierte Probe mithilfe desselben Spitzentyps unverzüglich in eine Vertiefung einer rundenbodigen 96-Loch-Gewebekulturplatte. Geben Sie 60 Mikroliter 100 % Isopropanol zur Probe hinzu.
Fügen Sie 20 Mikroliter der Bead-Mischung zur Probe hinzu und mischen Sie durch dreimaliges bis viermaliges Auf- und Abpipettieren. Befolgen Sie die Schritte des Gesamt-RNA-Isolationskits, um die Gesamt-RNA-Extraktion abzuschließen. Messen Sie abschließend Reinheit und Konzentration der gewonnenen Gesamt-RNA. Daten aus Mikrodissektionen verschiedener Hirnregionen sind in dieser Tabelle dargestellt.
RNA-Proben, die mit 30 Mikrolitern Elutionspuffer versetzt wurden, ergaben ausreichend Gesamt-RNA für die Verwendung mit kommerziell verfügbaren cDNA-Präparationsprodukten für RNA-Sequenzierungsanwendungen. Zusätzlich sind die RNA-Ausbeute und die 260- zu 280-nm-Verhältnisse Einzelwerte, die aus jeweiligen mikrodissezierten Proben stammen, um Messwerte aus jeder Hirnregion darzustellen, und sie bestätigen die hohe Probereinheit. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in acht bis zehn Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Risiko einer RNA-Kontamination von Arbeitsflächen oder Gewebeproben durch ausschließliche Verwendung RNA-freier oder DNase-behandelter Materialien zu minimieren.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur RNA-Expressionsprofilierung in definierten Regionen des Maushirns beschrieben, wobei ein besonderer Schwerpunkt auf einer präzisen und reproduzierbaren Strategie zur Gewebegewinnung liegt. Die Methode kombiniert die koronare Schnittführung des Gehirns mit einer mikrodissektionsbasierten Gewebeentnahme mithilfe eines Gewebecorers, um hochwertige Gesamt-RNA zu erhalten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Molekularbiologie
- RNA-Profiling
Hintergrund
- Die Profilierung der RNA-Expression ist entscheidend für das Verständnis der Gehirnfunktion.
- Präzise Gehirnkerne erfordern eine sorgfältige Dissektion für eine genaue Analyse.
- Die Aufrechterhaltung einer RNase-freien Umgebung ist für die Integrität der RNA unerlässlich.
- Bisherige Methoden wiesen Mängel in Konsistenz und Reproduzierbarkeit auf.
Zweck der Studie
- Etablierung eines zuverlässigen Protokolls zur RNA-Extraktion aus Maushirnregionen.
- Sicherstellung einer hohen RNA-Ausbeute und -qualität für nachgeschaltete Anwendungen.
- Erleichterung der Transkriptom-Profilierung durch verbesserte Methoden der Gewebesammlung.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer RNase-freien Arbeitsumgebung.
- Enthauptung und Entnahme des gesamten Gehirns der Maus.
- Gleichmäßiges Schneiden des Gehirngewebes mit einem mikrometergesteuerten Gewebeschneider.
- Mikrodissektion der Zielregionen des Gehirns unter Verwendung eines Gewebekerns in einem RNA-freien Medium.
Hauptergebnisse
- Es wurde eine hohe Ausbeute an Gesamt-RNA aus den dissezierten Hirnkernen gewonnen.
- Die Qualität der RNA wurde als geeignet für die Herstellung einer cDNA-Bibliothek bestätigt.
- Die Ergebnisse untermauern die Eignung der Methode für die Transkriptom-Profilierung.
- Analysen zeigten eine ausreichende RNA-Qualität für nachgeschaltete Anwendungen.
Schlussfolgerungen
- Das beschriebene Protokoll bietet einen zuverlässigen Ansatz für die RNA-Extraktion.
- Es verbessert die Konsistenz und Qualität von RNA-Proben aus Maushirnregionen.
- Diese Methode ist vorteilhaft für zukünftige neurowissenschaftliche Forschung, die RNA-Analysen beinhaltet.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieser Mikrodissektionsansatz ermöglicht die reproduzierbare, hochgradige Isolierung von gesamter RNA aus definierten Maushirnregionen und löst ein zentrales Engpassproblem bei der Zielvalidierung in der Neurowissenschaft, bei dem geringe RNA-Ausbeuten aus der Laser Capture-Mikroskopie die Transkriptomprofilierung behindern. Durch die Bereitstellung konsistenter RNA-Qualität, die für die Next-Generation-Sequenzierung geeignet ist, unterstützt die Methode die mechanistische Risikominderung von ZNS-Zielen und verbessert die Vorhersagesicherheit in frühen Entdeckungsworkflows. Sie stellt eine skalierbare, kosteneffiziente Alternative für genexpressionsbasierte Studien spezifischer Hirnregionen in der präklinischen Zielbewertung dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Isolierung von RNA aus spezifischen Hirnkernen, um die Korrelation zwischen Transkriptexpression und neuronaler Schaltkreisfunktion sowie Verhaltensphänotypen zu untersuchen.
- Operativer Wert: Bietet wiederholbare, kosteneffiziente Probenentnahme aus mehreren diskreten Regionen pro Maus, wodurch der Tierversuchseinsatz reduziert und der Durchsatz für die Absicherung von Zielstrukturen erhöht wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert Gesamt-RNA mit ausreichender Ausbeute und Reinheit für nachgeschaltete RNA-Seq- und qRT-PCR-Analysen und ermöglicht so die zuverlässige Entwicklung von Assays zur Genexpressionsanalyse in Gehirngewebemodellen.
- Operationaler Wert: Verwendet eine magnetische Bead-basierte RNA-Isolierung, die mit Hochdurchsatz-Workflows kompatibel ist, und unterstützt die Standardisierung über verschiedene Screening-Kampagnen hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die krankheitsrelevante transkriptomische Profilierung in Mausmodellen und unterstützt damit die Entdeckung translationsrelevanter Biomarker bei neuropsychiatrischen und neurodegenerativen Erkrankungen.
- Operativer Wert: Gewährleistet die RNA-Integrität durch RNase-freie Protokolle und verbessert dadurch die Reproduzierbarkeit in longitudinalen präklinischen Studien sowie die Vergleichbarkeit von Daten über verschiedene Labore hinweg.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Hypothesenprüfung über die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten ein, wobei eine präzise RNA-Profilierung bestimmter Hirnregionen die Auswahl und Priorisierung von Zielstrukturen vor der präklinischen Validierung unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Entrisikung, indem transkriptomische Vergleiche zwischen diskreten Hirnregionen ermöglicht werden, die mit spezifischen neuronalen Schaltkreisen verknüpft sind.
- Screening: Erzeugt standardisierte RNA-Eingaben, die für die quantitative Genexpressionsanalyse geeignet sind und somit die Reproduzierbarkeit in Targetbindungstests verbessern.
- Analytik: Erstellt hochwertige RNA für die spektrophotometrische und fluorometrische Quantifizierung, wodurch eine präzise Normalisierung der Eingabemengen für Sequenzierungs- und PCR-basierte Anwendungen ermöglicht wird.
- Translationale Forschung: Verbindet die Expressionsprofilerstellung in der Entdeckungsphase mit der präklinischen Kontinuität, indem transkriptomische Daten aus definierten Hirnregionen bereitgestellt werden, die für die jeweilige Erkrankung relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Gewebesammlung und RNA-Isolierung, die in mehreren neurowissenschaftlichen Projekten und für verschiedene Target-Klassen eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unschärfen durch präzise, regionsspezifische Expressionsdaten im Gehirn reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch RNase-freie Arbeitsabläufe und minimale manuelle Bearbeitungszeit (8–10 Minuten pro Probe).
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem mehrere regionale Proben aus einem einzigen Tier gewonnen werden können, wodurch die Kosten für verlustreiche Methoden, die eine Amplifikation erfordern, gesenkt werden.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Targets, indem zuverlässige Transkriptomdaten für Go/No-Go-Entscheidungen in der CNS-Wirkstoffforschung bereitgestellt werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Neuroanatomie und RNase-freier Technik, um die Probengenauigkeit während der Dissektion und RNA-Extraktion zu bewahren.
- Hängt von dem Zugang zu einem mikrometergesteuerten Gewebeschneider, Gewebestanzern mit festgelegtem Durchmesser und RNA-Isolationskits auf Basis magnetischer Partikel ab.
- Setzt standardisierte RNase-freie Umgebungsprotokolle über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg voraus, um die Vergleichbarkeit der RNA-Qualität zwischen Studien sicherzustellen.
- Eine Anpassung an andere Hirnregionen oder Arten könnte eine Optimierung des Durchmessers der Gewebestanzen und der Schnittparameter erfordern.
- Praktische Einschränkung: Das manuelle Entnehmen von Gewebeproben kann im Vergleich zu automatisierten Lasermikrodissektionsystemen die Anwendung in extrem hohem Durchsatz begrenzen, bietet jedoch eine überlegene RNA-Ausbeute.
