Mikrodissektion des Mausgehirns in funktionell und anatomisch unterschiedliche Regionen
15. Februar 2021
Wir präsentieren ein praktisches, schrittweises, schnelles Protokoll für die Entfernung und Dissektion diskreter Regionen aus frischem Hirngewebe von Mäusen. Die Gewinnung von Hirnregionen für molekulare Analysen ist in vielen neurowissenschaftlichen Laboren zur Routine geworden. Diese Gehirnregionen werden sofort eingefroren, um qualitativ hochwertige transkriptomische Daten für die Analyse auf Systemebene zu erhalten.
Das Studium verschiedener Hirnregionen ist ein Sprungbrett zum Verständnis der molekularen und strukturellen Komplexität des Gehirns. Dieses Protokoll beschreibt eine systematische Dissektion des Mausgehirns, um verschiedene Hirnregionen zu isolieren. Aus der Perspektive der Gehirnanatomie ist es ein Top-Down-Ansatz, der leicht reproduzierbar ist.
Dieses Protokoll bietet zwei Vorteile. Erstens bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, molekulare Grundlagen kleiner, aber kritischer Hirnregionen zu verstehen. Zweitens ist dieser gesamte Dissektionsprozess kurz genug, um die Erhaltung der molekularen Integrität zu gewährleisten, eine entscheidende Voraussetzung für Rücken- und molekulare Assays.
Dieses Verfahren erfordert Übung und schonende Handhabung. Das Timing ist hier sehr wichtig, um die strukturellen Wahrzeichen zu erhalten, und kann mit richtiger Ausbildung und Übung erreicht werden. Seid Muhie, ein Forschungschemiker und Bioinformatiker aus unserem Labor, demonstriert das Verfahren der Entfernung des Gehirns von Mäusen.
James Meyerhoff, ein Neurowissenschaftler aus unserem Labor, wird das Verfahren der Hirndissektion von Mäusen weiter demonstrieren. Um zu beginnen, reinigen und entfernen Sie die Haut für einen guten Halt. Klemmen Sie den Oberkiefer des enthaupteten Kopfes mit einem Hämostat und verwenden Sie eine Gaze, um die Kopfhaut rostral zu reflektieren.
Führen Sie die fein gebogene Schere in das Foramen magnum ein, um die anhaftenden Hirnhäute zu trennen. Führen Sie dann die Schere an der Öffnung der Schädelbasis ein, wo das Rückenmark verläuft, wobei die Klinge vertikal zeigt, aber parallel zur Innenfläche des Basalplattenknochens und gegen sie drückt, wobei die Klinge um 45 Grad nach links und dann nach rechts gedreht wird. Entfernen Sie das Hinterhauptsbein im intraparietalen Knochen, um das Kleinhirn freizulegen.
Schieben Sie die Schere rostral entlang der mittleren sagittalen Naht bis zum Bregma und schneiden Sie sie durch Anheben nach oben, um eine Platzwunde der zerebralen Kortikale zu vermeiden. Wenn die Parietaknochen angehoben werden, identifizieren und schneiden Sie die verbleibenden meningealen Anhänge. Machen Sie zwei parallele Schnitte in der sagittalen Ebene und entfernen Sie die Fragmente des Stirnbeins, um eine Verletzung der Gehirnoberfläche zu vermeiden.
Während Sie meningeale Anhänge und Hirnnerven schneiden, drehen Sie den Schädel um, damit die Schwerkraft die Entfernung des Gehirns in eine kleine Tasse unterstützen kann, die mit Kochsalzlösung vorgefüllt ist. Halten Sie die Gehörbulle intakt, damit die Anatomie der Hypophyse identifizierbar ist. Machen Sie einen extrem kleinen parasaggitalen Schnitt auf beiden Seiten im Kamm des Membranzeltes, das die Hypophyse an seiner Stelle hält, und heben Sie den hinteren Lappen der Hypophyse mit einer ultrafeinen Pinzette an.
Machen Sie einen sagittalen Schnitt zwischen den seitlichen Rändern des Vorderlappens der Hypophyse im nächsten Trigeminusnerv und heben Sie dann den Vorderlappen der Hypophyse heraus. Richten Sie die Quelle des weißen Lichts über das Gewebe. Legen Sie das Gehirn auf einen vorgekühlten Edelstahlblock und halten Sie den Block kalt, indem Sie ihn mit Eis in einer eiskalten Salzlösung umgeben.
Befeuchten Sie das Gewebe regelmäßig mit eiskalter Kochsalzlösung, um die Strukturen zu erhalten. Positionieren Sie das Gehirn so, dass die Hirnkortices nach oben zeigen. Entfernen Sie mit einer kleinen gebogenen Pinzette das Kleinhirn.
Schieben Sie mit dem dorsalen Ansatz die geschlossenen Klingen einer kleinen gebogenen Pinzette unter das Corpus callosum und spreizen Sie es vorsichtig, um den Neokortex bilateral zurückzuziehen, um die kritisch hervorstechenden Mittellinien-Orientierungspunkte zu erhalten. Schließlich wären Strukturen wie optischer Chiasma, Hypothalamus, Riechkolben, Medulla oblongata, Hypophysenschaft und Pontinbrücke sichtbar. Versuchen Sie, die Hemisphären zu trennen.
Drehen Sie die ventrale Stelle des Gehirns nach oben und machen Sie einen mittleren sagittalen Schnitt, beginnend vom Rücken zwischen den Riechkolben in den Gehirnhemisphären. Entfernen Sie Medulla und trennen Sie dann vorsichtig die beiden Hemisphären. Als nächstes machen Sie einen koronalen Schnitt am inneren Rand der Teiche, um das Hinterhirn zu erhalten und die Medulla am hinteren Rand der Teiche zu trennen.
Drehen Sie das Hirngewebe um, um die beiden Gehirnhälften sorgfältig zu trennen. Entfernen Sie bei diesem Schritt den Riechkolben. Machen Sie einen koronalen Schnitt einen Millimeter vor dem Genu des Corpus callosum und entfernen Sie die zusätzlichen Riechkolben, gefolgt von der Trennung des medialen und lateralen präfrontalen Kortex.
Teilweise horizontal oder koronal durch den transversalen Teil der vorderen Kommisssur von der Mittellinie unter dem Vorderhorn des lateralen Ventrikels schneiden, um den Septumkern dorsal und das ventrale Striatum ventral zu befreien. Entfernen Sie die kleine Menge des Kortex von der lateralen Oberfläche, um den Kern und den Riechtuberkel zu entfernen. Trennen Sie den rostralen Teil des Corpus striatum vom darüber liegenden Kortex durch ein gebogenes Skalpell, das direkt außerhalb der äußeren Kapsel geschnitten wird.
Identifizieren Sie die Septumkerne oder das Septum und isolieren Sie sie aus diesem Abschnitt. Machen Sie einen gebogenen Schnitt, um den Hypothalamus bei diesem Schritt zu trennen. Dies geschieht mit einem partiellen koronalen Schnitt hinter den Mammillarkörpern, der sich nur seitlich bis zum hypothalamischen Sulcus erstreckt.
Dann befreien Sie den Hypothalamusquerschnitt mit einem parasagittalen Schnitt entlang der Länge des hypothalamischen Sulcus. Evert den lateralen Ventrikel, um zusätzliche intralimbische Verbindungen in den verbleibenden limbischen Systemkomponenten aufzudecken. Auf der Innenseite des inneren Kortex wird nach dem Öffnen des Ventrikels eine fächerartige Struktur beobachtet.
Verwenden Sie die fächerartige Struktur im entorhinalen Kortex, um die Ränder zum Zwecke der Dissektion zu definieren, identifizieren und entfernen Sie dann die Amygdala, den entorhinalen Kortex, den posterioren cingulären Kortex und den Hippocampus. Bestätigen Sie die Identifizierung des Thalamus durch Visualisierung der Stria medullaris auf ihrer dorsalen Oberfläche, die sich in der mittleren rostralen kortikalen Ebene erstreckt. Trennen Sie den Thalamus vollständig vom Mittelhirn durch einen koronalen Schnitt.
Dieses Protokoll kann zur sofortigen Entfernung des Gehirns aus dem Schädel verwendet werden, gefolgt von einer Dissektion. Die sezierten Gewebe können je nach den Anforderungen der Studie konserviert und später verarbeitet werden. Extrahierte RNA aus mehreren sezierten Geweben kann auf Genexpression untersucht werden.
Die repräsentativen Ergebnisse wurden mit entnommenen Gehirnen erzielt, die vor der RNA-Extraktion mehrere Monate bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurden. Unterschiedliche Hirnregionen zusammen mit Gewichtsdaten wurden im Rahmen des Studienaggressor-exponierten sozialen Stressmodells von PTBS gesammelt. RNA-Konzentrationen und spektrophotometrische Messwerte sind hier dargestellt.
Wenn Sie dieses Protokoll befolgen, stellen Sie sicher, dass das Gewebe jederzeit gekühlt ist, indem Sie das Gehirn auf einem Eisstahlblock halten und das Gewebe regelmäßig mit Eiskochsalzlösung übergießen. Sobald Gewebe gesammelt und sofort eingefroren sind, können sie zu einem späteren Zeitpunkt für Assays wie Transkriptomik, Metabolomik und Proteomik verwendet werden.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein praktisches, Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Entfernung und Dissektion des Maushirns vor, um unterschiedliche Hirnregionen zu isolieren. Die Methode gewährleistet die molekulare Integrität des Gewebes und ermöglicht eine hochwertige transkriptomische Analyse wichtiger Hirnregionen. Das Protokoll ist so konzipiert, dass es einfach und leicht reproduzierbar ist, um molekulare Untersuchungen in der Neurowissenschaft zu unterstützen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Gehirnanatomie
- Molekulare Analyse
Hintergrund
- Das Verständnis der molekularen und strukturellen Komplexität des Gehirns ist entscheidend für Fortschritte in der Neurowissenschaft.
- Die Präparation einzelner Hirnregionen ermöglicht gezielte molekulare Untersuchungen.
- Die Erhaltung der Gewebestruktur während der Präparation ist entscheidend für nachfolgende Analysen.
- Training und Übung sind erforderlich, um die Präparation korrekt durchzuführen.
Zweck der Studie
- Eine effiziente Protokollmethode für die Maushirn-Präparation bereitzustellen.
- Die molekulare Analyse kleiner, aber entscheidender Hirnregionen zu ermöglichen.
- Die Qualität der transkriptomischen Daten, die aus präparierten Hirnregionen gewonnen werden, zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Das Protokoll beinhaltet die systematische Entnahme des Maushirns aus dem Schädel, gefolgt von der Dissektion spezifischer Regionen.
- Kritische Schritte umfassen sorgfältiges Schneiden und Handhaben, um die Strukturen zu erhalten und die molekulare Integrität zu maximieren.
- Die dissezierten Gewebe werden zur RNA-Extraktion aufbereitet und können auf Genexpression analysiert werden.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll gewährleistet eine schnelle und präzise Dissektion von Maus-Hirnregionen unter gleichzeitiger Erhaltung der molekularen Integrität.
- Ermöglicht die Isolierung von RNA für nachgeschaltete transkriptomische Analysen und verbessert dadurch die molekulare Untersuchung.
- Erleichtert die Identifizierung und Isolierung von Hirnstrukturen, die für weitere Untersuchungen von Bedeutung sind.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt eine detaillierte Methodik für die Maushirndissektion bereit, die für die molekulare Neurowissenschaftsforschung von entscheidender Bedeutung ist.
- Das konservierte Gewebe kann in transkriptomischen Studien verwendet werden, um das Verständnis von Hirnfunktionen zu vertiefen.
- Die Implikationen reichen bis zu einem besseren Verständnis neuronaler Mechanismen und möglichen Anwendungen beim Verständnis von Krankheiten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die präzise anatomische Dissektion von Maushirnregionen ermöglicht eine gezielte molekulare Analyse, die für die Zielvalidierung in der Neurowissenschaft von entscheidender Bedeutung ist. Dieses Protokoll unterstützt die phänotypische Bildschirmanalyse und die mechanistische Risikominderung, indem es funktionell relevante Strukturen für nachgeschaltete Assays isoliert. Die Aufrechterhaltung der Gewebestruktur gewährleistet zuverlässige transkriptomische Daten für die Entwicklung präklinischer Modelle und die Entdeckung von Biomarkern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch regionspezifische Genexpressionsanalyse.
- Operationaler Wert: Bietet anatomisch definierte Proben zur Validierung des Target-Engagements in krankheitsrelevanten Systemen.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die biologische Ent-Risikobewertung, indem molekulare Veränderungen mit spezifischen Hirnstrukturen verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die standardisierte Assay-Entwicklung in der Neuropharmakologie vor.
- Operationaler Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit und quantitativen Ergebnisse sicher, die für die Konsistenz von Screening-Kampagnen unerlässlich sind.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform über mehrere Zielklassen und Substanzbibliotheken hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem regionsspezifische molekulare Profile erhalten bleiben.
- Operativer Wert: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung durch konsistente Gewebepräparation über verschiedene Studien hinweg.
- Translationale Biomarker-Ausrichtung: Unterstützt die Identifizierung regionsspezifischer Biomarker, die mit phänotypischen Ergebnissen korrelieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Zielidentifizierung bis zur Leitstruktur-Optimierung, indem sie eine regionsaufgelöste molekulare Profilierung ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch anatomisch präzise Gewebeisolation.
- Screening: Stellt assaysbereite Proben mit erhaltener molekularer Integrität für eine zuverlässige Wirkstoffbewertung bereit.
- Analytik: Erzeugt quantitative RNA-Expressionsmesswerte, die den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen und die Priorisierung von Zielstrukturen erleichtern.
- Translationale Forschung: Verbindet Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung mit der präklinischen Kontinuität durch Erhaltung des strukturellen und molekularen Kontexts.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine standardisierte Dissektionskapazität, die auf mehrere Neurowissenschaftsprojekte und therapeutische Bereiche übertragbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Steigert die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unschärfen bei studien zu spezifischen Hirnregionen reduziert werden.
- Operationaler Wert: Bietet Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit für neurowissenschaftliche Forschungsprogramme an mehreren Standorten.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten durch bessere Zielvalidierung und geringeres biologisches Risiko in späteren Entwicklungsstadien.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung basierend auf molekularen Daten aus spezifischen Hirnregionen, gewonnen aus validierten präklinischen Modellen.
Durchführungsaspekte
- Setzt Fachkenntnisse in Neuroanatomie und mikrochirurgischen Techniken zur präzisen Identifizierung anatomischer Landmarken voraus.
- Benötigt spezielle Instrumente wie feine gebogene Scheren, Pinzetten und gekühlte Präparationsflächen.
- Erfordert eine standardisierte Durchführung der Präparationsprotokolle innerhalb und zwischen Forschungsteams, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Laboren sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungen, wenn die Methode auf verschiedene Mausstämme oder Entwicklungsstadien angewendet wird.
- Ist durch das Risiko des Gewebeabbaus eingeschränkt, falls die Präzision bezüglich der Präparationsdauer oder der Temperaturregelung nicht gemäß Protokoll eingehalten wird.
