Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe verschiedener virologischer und biochemischer Ansätze die Rolle eines zellulären Signalwegs bei der lytischen Replikation eines modellhaften Herpesvirus zu untersuchen. Als Beispiel analysieren wir hier die Rolle des mitochondrialen antiviralen Signalmoleküls Mavs während einer Infektion mit dem Herpesvirus Gamma-HV-68. Um zunächst die Funktion von Mavs während einer akuten Infektion zu untersuchen, werden Wildtyp-Mäuse und Mavs-Knockout-Mäuse im Rahmen einer akuten Virusinfektion mit Gamma-HV-68 infiziert.

Die Mauslunge wird entnommen und die Viruslasten mittels Plaque-Assay bestimmt, bei dem die Proben seriell verdünnt und ausplattiert werden. Anschließend wird auf den Zellmonolagen die Anzahl der Plaques gezählt. Erhöhte Viruslasten bei den Knockout-Mäusen deuten darauf hin, dass das Gen von Interesse eine antivirale Rolle spielt.

Im Gegensatz dazu deuten verringerte Viruslasten in Knockout-Mäusen darauf hin, dass das Gen für eine Virusinfektion erforderlich ist. Um diese Ergebnisse zu bestätigen, werden die mehrstufigen Wachstumskinetiken des Virus in vitro in embryonalen Mausfibroblasten untersucht. Wildtyp- und mavs-Knockout-embryonale Mausfibroblasten werden mit gamma-HV-68 infiziert und für unterschiedliche Zeiträume inkubiert. Anschließend werden die Zellen gesammelt und Plaque-Assays durchgeführt, um die mehrstufigen Wachstumskinetiken zwischen Wildtyp-Zellen und mavs-defizienten Zellen zu vergleichen.

Um diese Ergebnisse weiter zu validieren, werden Wildtyp- und Mavs-Knockout-Mausembryonal-Fibroblasten mit Gamma-HV-68 infiziert. Anschließend werden DNA und RNA getrennt aus den infizierten Zellen isoliert, und die viralen genomischen Transkripte werden mittels Echtzeit-PCR analysiert. Die Idee zu diesem Protokoll entstand ursprünglich, als wir die Rolle eines Wirtsimmunitätswegs während einer virusbedingten lytischen Infektion untersuchten.

Dieses Protokoll kann potenziell angewendet werden, um die Regeln von Wirtssignalwegen während der Infektion durch andere Krankheitserreger zu untersuchen. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie sechs bis acht Wochen alten, geschlechtsgematchten Wurfgeschwistern aus Mäusen nach dem Versand eine Eingewöhnungsphase von vier Tagen ermöglichen. Das folgende Experiment wird in einer Biohazard-Einrichtung durchgeführt.

Bereiten Sie sich vor, indem Sie persönliche Schutzausrüstung anlegen, einschließlich Laborkittel, Handschuhe, Maske und Schuhüberzieher, und arbeiten Sie in einem Sicherheitswerkbank der Biosicherheitsstufe zwei. Bereiten Sie die virale Suspension mit 40 bis 10.000 PFU von gamma HV 68 und 30 Mikrolitern steriler PBS pro Maus, die infiziert werden soll, vor.

Halten Sie die virale Suspension nach einer intraperitonealen Injektion von Ketamin-Xylazin auf Eis. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse sediert sind, indem Sie einen Zehenquetschtest durchführen. Geben Sie dann mithilfe einer Pipette 30 Mikroliter der viralen Suspension tropfenweise in das linke oder rechte Nasenloch ab.

Legen Sie die Maus fünf bis zehn Minuten lang auf die Seite, um die Übertragung des Virus über die Atemwege in die Lunge zu erleichtern. Danach stellen Sie die Mäuse zurück in ihren Käfig und beobachten Sie sie, bis sie sich vollständig von der Sedierung erholt haben. Anschließend wird Lungenmaterial von den injizierten Mäusen gewonnen, um ein Zelllysat herzustellen, mit dem die Viruslast an verschiedenen Tagen nach der Infektion bestimmt wird.

Legen Sie die Lungen, die von geopferten Mäusen gewonnen wurden, in sterile 1,5-Milliliter-Schraubverschlussgefäße, die 500 Mikroliter 1,0-Millimeter-Zirkonia-Silikabeads enthalten, und stellen Sie sie auf Eis. Falls der nächste Schritt nicht am selben Tag durchgeführt wird, lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius.

Falls erforderlich, ein Milliliter kaltes, serumfreies DMEM hinzufügen. Das Röhrchen in einen Zellzerreißer geben und die Start-Taste drücken, um die Lungen 30 Sekunden lang zu homogenisieren. Um eine Überhitzung der Probe zu vermeiden, die das Virus inaktivieren könnte.

Kühlen Sie das Röhrchen nach 30 Sekunden Homogenisierung mindestens eine Minute lang auf Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang anschließend. Zentrifugieren Sie das homogenisierte Gewebe danach bei 16.000 RCF und vier Grad Celsius für eine Minute.

Nach der Zentrifugation befindet sich der Zelltrümmer am Boden des Röhrchens, während die Lipide an der Oberfläche schwimmen. Entnehmen Sie sofort die Probe wie hier gezeigt, um einen Plaque-Assay unter Verwendung einer NIH 3T3- oder BHK-21-Monolayerzellschicht durchzuführen. Als Nächstes wird ein Plaque-Assay durchgeführt, um die im Probenmaterial enthaltene Virus-Titer zu bestimmen; beginnen Sie den Plaque-Assay mit der Herstellung einer seriellen Verdünnung des viralen Überstandes.

Zunächst mit einer Mehrkanalpipette 270 Mikroliter Medium in eine 96-Loch-Platte geben. Die erste Reihe bleibt frei. Danach 200 Mikroliter Überstand in die erste Reihe der 96-Loch-Platte geben, wobei jede Probe im Dreifachansatz angesetzt wird.

Übertragen Sie anschließend 30 Mikroliter der Probe aus der ersten Reihe in die nächste Reihe und mischen Sie gründlich. Danach übertragen Sie 30 Mikroliter der Mischung in die nächste Reihe und mischen erneut. Wiederholen Sie diesen Schritt mehrfach, um zehnfache serielle Verdünnungen herzustellen.

Fügen Sie anschließend das verdünnte virale Überstandmedium auf die Zellmonoschicht hinzu, in einer 24-Loch-Platte. Stellen Sie die Platte in einen Inkubator und schütteln Sie sie alle 30 Minuten während einer zweistündigen Inkubation. Nach der Inkubation entfernen Sie Zelltrümmer, indem Sie das Überstandmedium von der Platte abpipettieren.

Anschließend die Zellen einmal mit frischem Medium waschen. Nach der Wäsche Medium, das Methylcellulose enthält, zu den Zellen geben. Die Zellen vier bis sechs Tage inkubieren.

Nachdem vier bis sechs Tage vergangen sind, verwenden Sie ein Mikroskop, um die Plaque-Anzahl für jede Probe abzulesen. Notieren Sie die Anzahl der Plaques für jede Verdünnung.

Berechnen Sie anschließend den Mittelwert und die Standardabweichung. Wells mit zu vielen oder zu wenigen Plaques können nicht zur genauen Bestimmung der Titer verwendet werden. Verwenden Sie daher für jede Probe eine Verdünnung, bei der sich sieben bis 70 Plaques befinden.

Diese 1000-fach verdünnte Probe weist eine durchschnittliche Anzahl von 23 Plaques pro Bohrung auf. Um die Virus-Titer in der unverdünnten Lösung zu berechnen, multiplizieren Sie den Verdünnungsfaktor mit der Anzahl der Plaques und mit der Anzahl der Mikroliter pro Milliliter. Anschließend teilen Sie diesen Wert durch das Volumen der pro Bohrung zugegebenen verdünnten Überstandslösung.

Also ergibt sich in diesem Beispiel: 1000 mal 23 Plaques mal 1000 Mikroliter pro Milliliter, dividiert durch 100 Mikroliter, gleich 2,3 mal 10 hoch fünf bildende Einheiten pro Milliliter. Als Nächstes wird eine Virusstammlösung mit bekanntem Titer verwendet, um die Wachstumskinetik von gamma HV 68 in murinen embryonalen Fibroblasten zu bestimmen. Beginnen Sie damit, Wildtyp-Zellen und Zellen, die für ein Wirtsgen defizient sind, in eine 24-Loch-Platte mit jeweils 10.000 Zellen pro Loch aufzuteilen. Am folgenden Tag ersetzen Sie das Medium in jedem Loch durch 0,5 Milliliter einer Suspension von gamma HV 68 mit niedrigem MOI.

Stellen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in den Inkubator und lassen Sie die Inkubation währenddessen zwei Stunden lang durchlaufen. Schütteln Sie die Platte alle 30 Minuten nach der Inkubation. Entfernen Sie die virale Suspension mit einer Pipette und geben Sie 0,5 Milliliter frisches komplettes DMEM mit 8 % fetalem bovinem Serum zu den virusinfizierten Zellen hinzu.

Stellen Sie die Zellen an verschiedenen Tagen nach der Infektion zurück in den Inkubator. Gewinnen Sie das Medium und die Zellen, indem Sie sie mehrmals auf- und abpipettieren. Überführen Sie sie sofort in sterile 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und frieren Sie die Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius ein, um gamma HV 68 aus den Mets freizusetzen.

Führen Sie drei Zyklen aus Einfrieren und Auftauen durch. Tauen Sie die Zellen auf, indem Sie sie bei 37 Grad Celsius platzieren. Anschließend wirbeln Sie sie vortexartig um und stellen sie wieder in den minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank.

Bestimmen Sie die virale Titer mittels Plaque-Assay unter Verwendung einer NIH-3T3- oder BHK-21-Einschicht, wie zuvor gezeigt, um zu untersuchen, ob die DNA- oder RNA-Replikation durch einen Mangel an Wirtsgenen oder viralen Genen beeinflusst wird. Beginnen Sie mit infizierten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion, entfernen Sie das Überstand, spülen Sie die Zellen mit kaltem PBS und setzen Sie die Zellen mit Trypsin auf Eis. Anschließend pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1000 RCF bei Raumtemperatur für eine Minute; nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand und lagern die Zellen bei minus 80 Grad Celsius.

Extrahieren Sie die gesamte DNA und RNA, die sowohl vom Wirt als auch vom Virus stammen. Zentrifugieren Sie anschließend die Säulchen. Führen Sie eine Echtzeit-PCR mit der gesamten DNA und einem für virale lytische Transkripte spezifischen Primer durch.

Bestimmen Sie die relative Menge des intrazellulären Gamma-HV-68-Genoms in Bezug auf ein zelluläres Housekeeping-Gen wie Beta-Aktin. Bereiten Sie cDNA aus Gesamt-RNA und Oligo-dT-Primer vor. Führen Sie eine Echtzeit-PCR unter Verwendung von cDNA und den oben genannten Primern durch, um die relative Menge viraler Transkripte zu bestimmen.

In Bezug auf das des Wirts housekeeping-Gen Mavs steht kurz für mitochondriale antivirale Signalübertragung, wie hier gezeigt. Das Adaptermolekül Mavs leitet Signale von zytosolischen RIG-I-ähnlichen Rezeptoren weiter, um NF-kappaB und interferonregulatorische Faktoren (IRFs) zu aktivieren, die wiederum die Genexpression proinflammatorischer Zytokine und Interferone hochregulieren. Die Viruslasten in der Lunge von gamma-HV-infizierten Wildtyp-Mäusen und den Mavs-defizienten Mäusen aus derselben Wurfgruppe sind hier dargestellt.

Ein Mangel an Mavs verringerte die Viruslast in der Lunge 10 Tage nach der Infektion signifikant, was darauf hindeutet, dass Mavs für eine effiziente Virusinfektion in vivo erforderlich ist. Diese Abbildung zeigt eine mehrstufige Virusvermehrungskurve an embryonalen Fibroblasten von Wildtyp-Mäusen und solchen mit Mavs-Mangel. Die signifikant verzögerte Virusvermehrung auf embryonalen Fibroblasten der Maus weist darauf hin, dass Mavs für eine effiziente virale Replikation in vitro erforderlich ist. Die mRNA-Spiegel viraler lytischer Gene in mit Gamma-HV-68 infizierten embryonalen Fibroblasten der Maus wurden mittels Echtzeit-PCR analysiert. Ein Mangel an Mavs verringerte signifikant die mRNA-Spiegel dreier essentieller lytischer Gene.

All diese Ergebnisse unterstützen gemeinsam die Schlussfolgerung, dass Mavs für die Transkriptionsaktivierung und die lytische Replikation von gamma HV 68 erforderlich ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Wirt-Pathogen-Interaktion auf mehreren Ebenen sowohl in VO als auch in Vevo untersucht. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Pathogenen äußerst heikel sein kann.

Es sollten Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden, während die Durchführung erfolgt.