Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Trennung gemischter Virusgesellschaften basierend auf ihrer Nukleinsäurezusammensetzung. Dies ermöglicht die Untersuchung der taxonomischen Diversität und des funktionellen Potenzials komplexer Virusgesellschaften. Hierbei wird Hydroxylapatit, eine kristalline Form von Calciumphosphat, zur Trennung von Nukleinsäuren eingesetzt.

Zunächst wird eine Hydroxylapatitsäule gepackt und äquilibriert. Anschließend werden gereinigte virale Nukleinsäuren auf die Säule aufgetragen, wobei die Ladungswechselwirkung zwischen den positiv geladenen Calciumionen des Hydroxylapatits und dem negativ geladenen Phosphatrückgrat der Nukleinsäure-Subtypen die Bindung der Nukleinsäuren an die Säule bewirkt. Danach werden einzelsträngige DNA-RNA sowie doppelsträngige DNA nacheinander mit unterschiedlichen Konzentrationen von Phosphatpuffer eluiert. Die resultierenden Nukleinsäuren werden anschließend entzuckert und konzentriert, um sie für die Visualisierung, Quantifizierung und Identifizierung mittels DNA-Sequenzierung vorzubereiten. Die Agarose-Gelelektrophorese bestätigt, dass die Nukleinsäure-Spezies mit weniger als 9 % Übertrag getrennt werden können.

Daher ermöglicht diese Methode die Bewertung der Diversität und funktionellen Kapazität viraler Gemeinschaften. Hallo, mein Name ist Doug Fro, und ich bin wissenschaftlicher Mitarbeiter im Labor von Dr. Shannon Williamson am J. Craig Venture Institute. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur Trennung von einzelsträngiger DNA, doppelsträngiger DNA und RNA aus einer Umwelt-Virusgesellschaft.

Diese Methode bietet Vorteile gegenüber bestehenden Methoden wie der Behandlung mit dem Kern, die entweder DNA oder RNA gezielt angeht. Die Hydroxylapatit-Chromatographie kann die gesamte virale Gemeinschaft erfassen. Diese Methode ermöglicht es uns, mehrere Fragen auf dem Gebiet der viralen Ökologie zu beantworten.

Zum Beispiel: Wie sieht der gesamte Genbestand oder die Vielfalt der viralen Gemeinschaft aus? Wir kamen erstmals auf diese Methode, als wir die gesamten Planktonzusammensetzungen des Rio aus der Chesapeake Bay untersuchen wollten, ohne dabei einen Teil der genetischen Signatur zu opfern. Die für dieses Experiment benötigten Lösungen sollten gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Protokoll im Voraus hergestellt werden und umfassen 0,12 molares Phosphatpuffer, 0,20 molares Phosphatpuffer, 0,40 molares Phosphatpuffer sowie eine molare Phosphatlösung.

Alle Puffer auf pH 6,8 einstellen und Hydroxylapatit am Tag des Experiments hydratisieren; alle Phosphatpuffer und hydratisierten Hydroxylapatit durch Inkubation in einem 60 °C warmen Wasserbad äquilibrieren. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die Econo-Säule vorbereiten, die zur Trennung viraler Nukleinsäuren verwendet wird. Befestigen Sie einen Hahn am Ende der Econo-Säule und stellen Sie sicher, dass er geschlossen ist.

Unter Verwendung eines Pipettiergeräts deionisiertes Wasser auf die Säule geben, dann die Kappe auf das obere Ende der Säule setzen und die Säule wiederholt umdrehen, um sie zu spülen. Das Wasser abgießen und diesen Waschschritt mehrmals wiederholen. Anschließend den Hahn von der Econ-Säule entfernen und ihn zur Sterilisation autoklavieren.

Der Hahn darf nicht autoklaviert werden, da er schmelzen würde. Spülen Sie den Hahn mit ionisiertem Wasser, danach erneut mit 70 % Ethanol und lassen Sie ihn nach der Autoklavierung an der Luft trocknen. Setzen Sie den Hahn wieder ein und schließen Sie ihn.

Als Nächstes, unter Verwendung einer Abzugshaube, ein Milliliter Sigma-Beschichtungslösung zur Säule geben und die Glasoberfläche der Säule durch Umkehren der Säule mit einer rollenden Bewegung, wie hier gezeigt, gleichmäßig benetzen. Die Beschichtung mit der Sigma-Beschichtungslösung verhindert, dass Nukleinsäuren an der Glasoberfläche haften bleiben. Während der Trennung wurden die Glasoberflächen mit einer Salzbeschichtung versehen.

Öffnen Sie den Hahn und gießen Sie in ein kegelförmiges Reagenzglas ab. Befestigen Sie als Nächstes die Säule mit zwei Klammern an einem Stativ, um sie mit einem zirkulierenden Wasserbad zu verbinden. Schließen Sie einen Silikonanschlußschlauch vom zirkulierenden Wasserbad an, sodass die Wasserströmung vom Wasserbad von unten nach oben verläuft.

Stellen Sie die Temperatur auf 60 Grad Celsius ein und starten Sie die Zirkulation. In der Praxis wäre die Säule und die Schläuche normalerweise mit einem Isolationsmaterial wie Aluminiumfolie oder Schaumstoffrohrisolierung umhüllt. Um Wärmeverluste zu minimieren, wird dieser Schritt hier nicht gezeigt.

Um den Vorgang besser zu veranschaulichen, schließen Sie den Hahn. Geben Sie mit einer Pipette 10 Milliliter sterile, RNAsen-freies Wasser hinzu. Öffnen Sie den Hahn und lassen Sie das Wasser ablaufen.

Anschließend erneut gemäß dem zweiten Waschschritt waschen. Jeweils zweimal mit 10 Milliliter sterilem, RNAsen-freiem 0,12-molar Phosphatpuffer spülen und zwischen den Spülgängen abgießen. Die Säule ist nun bereit für die Hydroxylapatit-Chromatographie.

Stellen Sie sicher, dass der Hahn der Säule geschlossen ist. Fügen Sie dann mit einer sterilen zwei Milliliter-serologischen Pipette langsam zwei Milliliter der vorbereiteten resuspendierten rehydrierten Hydroxyapatit-Lösung auf den Säulenboden hinzu. Setzen Sie die Säulenkappe wieder auf.

Lassen Sie das Hydroxy-Applit aufgrund der Schwerkraft 30 Minuten lang absetzen. Bei dieser Methode ist größte Sorgfalt erforderlich. Die Hydroxy-Applit-Säule arbeitet mit einer Geschwindigkeit von 0,25 bis 0,5 Mils pro Minute.

Daher ist es sehr wichtig, die Säule genau zu überwachen, damit sie nicht austrocknet. Nach Ablauf von 30 Minuten öffnen Sie den Hahn, um das Pufferlösung in einen Abfallbehälter ablaufen zu lassen. Schließen Sie den Hahn und entsorgen Sie die Durchflussfraktion.

Kombinieren Sie Nukleinsäuren mit einem 0,12-molaren Phosphatpuffer zu einem Endvolumen von 500 Mikrolitern und inkubieren Sie die Lösung 10 Minuten bei 60 Grad Celsius. Dadurch werden die Nukleinsäuren auf die Temperatur der Säule eingestellt und die Trennung der verschiedenen Nukleinsäurearten wird verbessert, indem eventuell vorhandene sekundäre Strukturen aufgelöst werden. Tragen Sie die Nukleinsäurelösung mit einer zwei Milliliter umfassenden serologischen Pipette schnell auf den Hydroxyapatit auf, wobei darauf zu achten ist, die Säule nicht zu stören.

Wenn die gesamten 500 Mikroliter in die Säule eingeflossen sind, kann eine kleine Menge eines 0,12-molaren Phosphatpuffers auf die Säule gegeben werden, um zu verhindern, dass sie austrocknet. Lassen Sie die Nukleinsäuren 30 Minuten lang an das Hydroxyapatit binden. Nach der Bindungsinkubation stellen Sie einen 15-Milliliter-Kegelrohr unter die Säule.

Öffnen Sie dann den Hahn und sammeln Sie die ersten 500 Mikroliter Probe, die einzelsträngige DNA enthält. Sobald 500 Mikroliter gesammelt wurden, schließen Sie den Hahn. Fügen Sie anschließend sechs Milliliter 0,12-molares Phosphatpuffer zu der Hydroxyapatit-Säule hinzu, wobei darauf zu achten ist, die Säule nicht zu stören.

Öffnen Sie dann den Hahn und sammeln Sie weiterhin den Durchlauf, der einsträngige DNA enthält, in demselben 15-Milliliter-Röhrchen aus dem vorherigen Schritt. Nachdem etwa sechs Milliliter gesammelt wurden, schließen Sie den Hahn. Geben Sie eine äquivalente Menge einer Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Lösung zum Röhrchen hinzu und mischen Sie gründlich durch Vortexen. Zentrifugieren Sie anschließend bei 3.500 × g für 15 Minuten.

Nach der Zentrifugation enthält das Röhrchen zwei Schichten. Überführen Sie die obere durchsichtige Schicht, die den einzelsträngigen DNA enthält, in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen, und lagern Sie die Probe bei Raumtemperatur, um RNA aus der Säule zu eluieren und zu reinigen. Geben Sie sechs Milliliter 0,20-molarer Phosphatpuffer hinzu und sammeln Sie die Durchläufe, wobei Sie ein neues 15-Milliliter-Röhrchen verwenden. Führen Sie anschließend eine Phenol-Chloroform-Extraktion durch.

Was die Einzelstrang-DNA-Probe betrifft, wiederholen Sie diesen Vorgang unter Verwendung von sechs Milliliter 0,40 molarer Phosphatpufferlösung, um doppelsträngige DNA aus der Säule zu eluieren und zu reinigen. Abschließend, um die Säule von eventuell verbleibender doppelsträngiger DNA zu befreien, wiederholen Sie diesen Vorgang ein weiteres Mal.

Dieses Mal unter Verwendung von sechs Milliliter 1,00-molarer Phosphatpufferlösung, um die Nukleinsäureproben zu desalzieren. Überführen Sie vier bis fünf Milliliter jeder Probe in ein Ultra-4-Zentrifalfiltrationsgerät, das mit einer Ultrazellmembran mit einer Molekulargewichtsabscheidung von 30.000 ausgestattet ist, und konzentrieren Sie die Probe auf weniger als 500 Mikroliter, indem Sie sie etwa fünf Minuten lang bei 6.000 × g und 30 Grad Celsius in einem Festwinkelrotor zentrifugieren. Nach dem Verwerfen des Durchlaufs fügen Sie den Rest der Proben dem Filter hinzu.

Füllen Sie das Volumen mit RNAs-freiem 1×TE-Puffer auf vier bis fünf Milliliter auf. Zentrifugieren Sie erneut, bis ein konzentriertes Volumen erreicht ist. Fügen Sie etwa fünf Minuten nach der Zentrifugation vier bis fünf Milliliter RNAs-freien 1×TE-Puffer zum Filter hinzu und konzentrieren Sie erneut.

Wiederholen Sie diesen Waschgang erneut insgesamt fünfmal, um die Nukleinsäureproben vollständig zu desalzieren. Sobald die Proben vollständig konzentriert und desalziert sind, überführen Sie die verbleibenden Nukleinsäureproben in ein steriles 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fällen Sie die Nukleinsäuren durch Zugabe eines Zehntels des Volumens Natriumacetat, zweier Volumina 100 %igen Ethanol und eines Mikroliters Glyco-Blue, und mischen Sie gründlich durch Vortexen und Zentrifugieren.

Eine 28.000-GS-Zentrifugation bei vier Grad Celsius für 60 Minuten in Kent. Dabei sicherstellen, dass das Pellet nicht gestört wird.

Geben Sie 300 Mikroliter 70 % Ethanol hinzu und zentrifugieren Sie bei 28.000 × g und Raumtemperatur für 10 Minuten. Trocknen Sie die Probe nicht vollständig aus und resuspendieren Sie jede Fraktion in einem geeigneten Volumen an RNA-freiem TE-Puffer. Gleichkonzentrierte Anteile an den viralen Nukleinsäuren M13 MP18, einfachsträngige DNA, MS2, einfachsträngige RNA, fI6, doppelsträngige RNA, und Lambda, doppelsträngige DNA, wurden kombiniert und anschließend mittels Hydroxylapatit-Chromatographie getrennt, wie in diesem Video gezeigt. Gleichkonzentrierte Anteile an M13 MP18, einfachsträngige DNA, MS2, einfachsträngige RNA, fI6, doppelsträngige RNA, und Lambda, doppelsträngige DNA, wurden wie in Spur sechs dargestellt vereinigt und auf eine Hydroxylapatit-Säule aufgetragen, wie hier zu sehen ist.

Einzelsträngige DNA-RNA und doppelsträngige DNA wurden unabhängig voneinander mittels 0,12, 0,18, 0,40 und 1,00 molarer Phosphatpuffer von der Hydroxyapatitsäule eluiert. Eine 1-KB-Ladder wurde verwendet, um die Genomgrößen zu bestätigen. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Methode erfolgreich zur Trennung von einzelsträngiger DNA, doppelsträngiger DNA und RNA mit weniger als 9 % Übertragung von einer Fraktion zur nächsten eingesetzt werden kann.

Diese Methode wurde auch verwendet, um Nukleinsäuren zu trennen, die aus einer viralen Gemeinschaft innerhalb des Chesapeake Bay isoliert wurden, wie hier gezeigt. Einzelsträngige DNA-RNA und doppelsträngige DNA wurden unabhängig voneinander mit Phosphatpufferkonzentrationen von 0,12 mol, 0,20 mol und 0,40 mol bzw. 1,00 mol eluiert. Ein DNA-Massenladder mit hoher Masse in Spur eins und ein 1-KB-Ladder in Spur zwei dienten zur visuellen Bestätigung der ungefähren molekularen Masse und Masse der Nukleinsäuren. Wie hier zu sehen ist, war doppelsträngige DNA der dominante Typ der aus dem viralen Plankton des Chesapeake Bay extrahierten Nukleinsäuren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Nukleinsäuren aus einem gemischten viralen Assoziat mithilfe der Hydroxylapatit-Chromatographie trennt.

Dazu gehören die Herstellung der Hydroxylapatitsäule und der Nukleinsäuren, die Trennung und Elution der Nukleinsäuren mithilfe verschiedener Konzentrationen von Phosphatpuffer sowie die Entsalzung und Anreicherung der Nukleinsäuren nach der Trennung.