A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus
9. Januar 2013
Eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, die Qualität Malariaparasiten und Vektor-DNA aus mosquito Proben zu extrahieren beschrieben. Aufbauend auf chelatisierenden Eigenschaften der Chelex Harz, ermöglicht die einfache Methode Genotypisierung von Malaria-Parasiten in Mücken Mitte Darm und Speicheldrüsen Phasen sowie molekulare Identifizierung der Anopheles Geschwister Spezies durch PCR.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Malaria-, Parasiten- und Moskito-DNA aus den Mitteldarm- und Speicheldrüsenabschnitten von Anopheles-Proben zu extrahieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der Mückenkörper exakt an der Gelenkstelle zwischen Abdomen und Thorax durchtrennt wird, wodurch der Mitteldarm vom Speicheldrüsenabschnitt getrennt wird. Anschließend wird jeder Abschnitt getrennt in entionisiertem Wasser zerkleinert.
Anschließend wird die Gewebesuspension lysiert und gewaschen, und das Zellpellet wird gewonnen. Abschließend wird das Zellpellet rekonstituiert und erhitzt, und die DNA wird extrahiert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die hochwertige DNA von Mücken und Malariaerregern liefern, die als Vorlage zur Identifizierung von Anomalien, Vektorspezies und Genotypisierung von Malariainfektionen mittels PCR und allelespezifischer Restriktionsenzymverdauung geeignet ist.
Der Hauptvorteil dieser äußerst einfachen Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der organischen Extraktion und Sortierverfahren liegt darin, dass sie nur sehr wenige sichere und leicht verfügbare Reagenzien benötigt und zudem deutlich weniger Bearbeitungszeit erfordert. Um mit der Dissektion der Mücke zu beginnen, legen Sie sie auf ein kleines Stück Paraform und befestigen Sie sie am Stereomikroskop. Bedecken Sie sie mit einem Tropfen entionisiertem Wasser.
Um das Gewebe weicher zu machen, die Mückenkadaver präzise an der Gelenkstelle zwischen Thorax und Abdomen einschneiden. Auf diese Weise Kopf und Thorax vom Abdominalabschnitt abtrennen. Jeden präparierten Mückenabschnitt in ein sauberes, autoklaviertes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, das zuvor mit der Mücken-ID-Nummer und der entsprechenden Körperteilbezeichnung beschriftet wurde; die Parafolienhülle entsorgen und mithilfe eines mit 70 %igem Alkohol angefeuchteten Kim-Tuchs sorgfältig die Mikroskopbühne abwischen, bevor mit der nächsten Mücke fortgefahren wird. Um zuerst die Mücken-DNA zu extrahieren, pipettieren Sie zunächst 20 Mikroliter entionisiertes Wasser in das Probenröhrchen.
Und verwenden Sie die Pipettenspitze, um den untergetauchten Mückenabschnitt zu einer einheitlichen Suspension zu zerkleinern. Geben Sie 100 µL einer autoklavierten 1x PBS-Lösung mit 1 % Saponin zum Probenhomogenat und mischen Sie vorsichtig durch Vortexen. Inkubieren Sie die Probe 20 Minuten bei Raumtemperatur.
Zentrifugieren Sie anschließend bei 20.000 ×g für zwei Minuten und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 µL 1× PBS. Wiederholen Sie dann die Zentrifugation.
Geben Sie 75 Mikroliter sterilem, deionisiertem Wasser und 25 Mikroliter einer 20 %igen (Gewicht pro Volumen) Cellex 100 Harzsuspension in deionisiertem Wasser hinzu und wirbeln Sie vorsichtig um, um das Pellet mit einer sterilen 23-Gauge-Hypodermikannadel, die im Bunsenbrenner geflammt wurde, erneut in Suspension zu bringen. Stichen Sie ein Loch in den Deckel des Probenröhrchens.
Erhitzen Sie die Proben-Suspension 10 Minuten lang in einem Heizblock zum Kochen. Zentrifugieren Sie eine Minute bei 20.000 ×g und überführen Sie die DNA-Lösung in ein vorbeschriftetes Lagergefäß, um sie als Vorlage in PCR-Reaktionen zu verwenden, um die Qualität der extrahierten DNA zu überprüfen und einen Bereich des mitochondrialen Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Dehydrogenase-Subunit-4-Gens von Arthropoden zu amplifizieren, von dem erwartet wird, dass er ein 400 Basenpaare langes Fragment erzeugt. Als Nächstes amplifizieren Sie einen Bereich, der SNPs im intergenischen Spacer-Bereich flankiert, um zwischen den Ananais-Gambia-Arten zu differenzieren; hierbei werden Fragmentgrößen von 390 Basenpaaren für Ananais Gambia Sensu Stricto und 315 Basenpaaren für Ananais api erwartet.
Anschließend das Genotypisieren von Polymorphismen der p. falciparum-Antifolat-Resistenz durchführen. Mit einer nested PCR den Bereich amplifizieren, der die Aminosäurecodons 16, 51, 59, 108 und 164 flankiert. Im Dihydrofolat-Reduktase-Gen der Parasiten eine allelespezifische Verdauung des Amplikons durchführen, um die Antifolat-Resistenz nachzuweisen.
Assoziierte Polymorphismen. Überprüfen Sie die Reaktionen auf einem 2 %igen AROS-Gel. Beispiele für Ergebnisse von PCR-Analysen zur Beurteilung der DNA-Extraktqualität bei Mücken, zur molekularen Identifizierung mittels RABIS und zur Genotypisierung von p. falciparum zeigen, dass die vereinfachte Kelex-Methode im Vergleich zum Standard-Salting-out-Protokoll ähnliche Ergebnisse liefert, obwohl sie weniger Schritte erfordert und weniger als ein Viertel der Zeit in Anspruch nimmt. Bei vergleichbarer DNA-Qualität der jeweiligen Extrakte ist es nicht überraschend, dass die Positivitätsraten der Proben bezüglich Anophelis-Arten, Gambia-Geschwisterarten sowie Parasiteninfektionsraten nach dem Chi-Quadrat-Test nach McNear statistisch nicht unterschiedlich waren.
Die Zugabe von BSA zu Reaktionsgemischen führt zu einer allgemeinen Zunahme der PCR-Positivität aufgrund der Entfernung von PCR-Inhibitoren sowohl bei dem vereinfachten Kelex- als auch beim herkömmlichen Salting-out-Protokoll. Dieser Anstieg war jedoch mit Ausnahme der DNA-Qualität bei Kelex-Extrakten nicht statistisch signifikant. Die allelespezifische Restriktionsenzymverdauung des p-falciparum-Amplicons ermöglicht das Genotyping von Malaria-Infektionen in Mitteldarm und Speicheldrüse hinsichtlich Resistenzallele gegen Medikamente, sobald die Methode beherrscht ist.
Diese Technik sollte bei korrekter Durchführung in etwa 37 Minuten durchführbar sein.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine schnelle und kostengünstige Methode zur Gewinnung von hochwertiger DNA aus Malariaerregern und Mückenvektoren beschrieben. Mithilfe von Chelex-Harz ermöglicht die Technik eine effektive Genotypisierung von Malariaerregern sowie die molekulare Identifizierung von Anopheles-Arten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Genomik
Hintergrund
- Malaria ist ein bedeutendes globales Gesundheitsproblem, das durch Anopheles-Mücken übertragen wird.
- Herkömmliche Methoden zur DNA-Extraktion können zeitaufwendig sein und gefährliche Reagenzien erfordern.
- Es besteht Bedarf an einfacheren, sichereren und effizienteren Techniken zur DNA-Extraktion.
- Diese Studie stellt eine Methode vor, die diesen Anforderungen mithilfe von Chelex-Harz gerecht wird.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer schnellen und kostengünstigen Methode zur DNA-Extraktion aus Malariaerregern und Mückenvektoren.
- Möglichmachung der Genotypisierung von Malariaerregern und Identifizierung von Anopheles-Arten.
- Vergleich der Effizienz und Wirksamkeit der neuen Methode mit herkömmlichen Protokollen.
Verwendete Methoden
- Präparation von Mückenspezimen zur Trennung der Mitteldarm- und Speicheldrüsenabschnitte.
- Zermahlung des Gewebes in entionisiertem Wasser zur Herstellung einer Suspension.
- Verwendung von Chelex-Harz zur DNA-Extraktion.
- Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Genotypisierung und Artidentifizierung.
Hauptergebnisse
- Die Chelex-Methode liefert DNA in hoher Qualität, die für die PCR geeignet ist.
- Die Ergebnisse sind mit deutlich verkürzter Bearbeitungszeit vergleichbar mit denen traditioneller Methoden.
- Die Positivitätsraten der Proben für die Artdifferenzierung und Parasiteninfektionen waren zwischen den Methoden statistisch ähnlich.
- Die Zugabe von BSA verbesserte die PCR-Ergebnisse, indem Hemmstoffe reduziert wurden.
Schlussfolgerungen
- Die vereinfachte Chelex-Methode eignet sich zur DNA-Extraktion aus Malaria-Vektoren.
- Diese Technik kann in weniger als 40 Minuten durchgeführt werden und ist daher für den routinemäßigen Einsatz praktikabel.
- Sie bietet eine sicherere und effizientere Alternative zu herkömmlichen DNA-Extraktionsmethoden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
In ressourcenarmen Umgebungen erfordert die nachhaltige molekulare Überwachung von Malariavektoren und -parasiten DNA-Extraktionsverfahren, die Leistungsfähigkeit mit betrieblicher Einfachheit in Einklang bringen. Das auf Chelex basierende Protokoll liefert eine vergleichbare DNA-Qualität wie etablierte Salz-Ausfällungsverfahren, reduziert dabei jedoch den Reagenzienaufwand und die Bearbeitungszeit von fast drei Stunden auf unter 40 Minuten. Dadurch stellt die Methode ein praktisches Werkzeug dar, um skalierbare, kosteneffiziente Genotypisierungs- und Artidentifizierungsabläufe in Forschungs- und Kontrollprogrammen in endemischen Regionen zu ermöglichen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Vektor-Parasit-Interaktionen, indem DNA-Vorlagen für die Artdiagnose und die Beurteilung des Infektionsstatus bereitgestellt werden.
- Operativer Wert: Verringert den manuellen Arbeitsaufwand und den Reagenzienverbrauch und unterstützt eine höhere Durchsatzleistung bei der Aufbereitung von im Feld gesammelten Proben.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt DNA, die für PCR-basierte Analysen zur Diskriminierung von Vektorarten und Genotypisierung von Parasiten geeignet ist.
- Operationaler Wert: Verwendet nur drei Reagenzien (deionisiertes Wasser, Saponin, Chelex-Harz), verbessert die Standardisierung der Analyse und verringert die Variabilität in laboratorischen Einrichtungen mit begrenzten Ressourcen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Kontinuität von der Vektorsammlung bis zu nachgeschalteten Anwendungen wie der Genotypisierung von Arzneimittelresistenzen mittels nested PCR und Restriktionsverdau.
- Operativer Wert: Macht den Einsatz gefährlicher organischer Lösungsmittel überflüssig und verbessert dadurch die Sicherheit und Zugänglichkeit in Feldlabors.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich nahtlos in die Entdeckungskette von der Probenaufbereitung bis zur genetischen Analyse ein und ermöglicht zuverlässige Eingabedaten für PCR-basierte Identifizierungs- und Genotypisierungsverfahren.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung zur Verteilung von Vektorarten und Infektionsraten mit Plasmodium falciparum in Feldumgebungen.
- Screening: Liefert DNA-Extrakte mit ausreichender Qualität und Ausbeute für Multiplex-PCR-Anwendungen und unterstützt so die Bereitschaft der Assays.
- Analytik: Ermöglicht die quantitative Bewertung mittels PCR-Amplifikation von ND4, artenspezifischen SNPs und Genorten für Arzneimittelresistenzen, wodurch Vergleiche zwischen Probengruppen möglich werden.
- Translationale Forschung: Verbindet entomologische Überwachung mit der Genotypisierung von Parasiten und unterstützt so risikoadjustierte Entscheidungen bei Malariakontrollstrategien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die Einfachheit des Protokolls und der geringe Ausrüstungsbedarf (Mikrozentrifuge, Heizblock) ermöglichen die Übernahme an mehreren Feldstandorten und durch verschiedene Forschungsteams.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet vorhersagbare Sicherheit bei der Identifizierung von Vektorarten und dem Nachweis von Parasiten durch vergleichbare Empfindlichkeit und Spezifität mit etablierten Methoden.
- Operationaler Wert: Erzielt eine hohe Reproduzierbarkeit mit geringer Abhängigkeit von Reagenzien und verringert dadurch die Anfälligkeit der Versorgungskette in abgelegenen Gebieten.
- Strategischer Wert: Ermöglicht schnellere Entscheidungen über Fortsetzung oder Abbruch von Maßnahmen in Überwachungsprogrammen, indem die Zeit bis zum Ergebnis für die molekulare Bestätigung verkürzt wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Interventionen, indem zeitnahe und genaue Daten zur Vektorfähigkeit und Parasitenprävalenz bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert grundlegende Kenntnisse in Molekularbiologie für die Gewebedissektion, Homogenisierung und PCR-Setup.
- Benötigt Zugang zu einem Mikrozentrifugens, der 20.000 × g erreichen kann, sowie zu einem Heizblock für den Kochschritt.
- Die Standardisierung zwischen verschiedenen Teams profitiert von konsistenten Vortex- und Pipettiermethoden während der Homogenisierung und der Resuspension des Harzes.
- Die Anpassung an andere Mückenarten oder Probentypen könnte eine Validierung der Lyse-Effizienz und der Inhibitorenentfernung erfordern.
- Praktische Einschränkung: Das Verfahren beinhaltet einen manuellen Zerkleinerungsschritt, der eine automatisierte Hochdurchsatzanalyse ohne Modifikation möglicherweise begrenzt.
