Kryokonservierung von Maus Embryonen durch Ethylen-Glykol-Based Vitrification

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Maus-Embryonen in flüssigem Stickstoff einzufrieren und sie anschließend aufzutauen, um lebende Mäuse zu erhalten. Dies wird erreicht, indem Mausembryonen zunächst in ein Equilibrationsmedium getaucht, dann in ein Vitrifikationsmedium in einer Kryoröhre überführt und schließlich in einen flüssigen Stickstofftank gegeben werden. Später können die Embryonen in einem hochosmotischen Medium aufgetaut und in Kulturmedium inkubiert werden, bis sie in empfängliche Weibchen transferiert werden.

Letztendlich zeigen die Ergebnisse eine Überlebensrate von mehr als 90 % der Embryonen nach Vitrifizierung und Auftauen sowie Geburtenraten zwischen 30 und 70 % nach Embryotransfer. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das permeable Kryoprotektivum Glykol für die Embryonen weniger toxisch ist als herkömmliche Kryoprotektiva. Die Durchführung des Verfahrens wird von einer Technikerin aus meinem Labor demonstriert, bevor mit diesem Protokoll begonnen wird.

Bereiten Sie zwei Zell-Maus-Embryonen, die durch natürliche Paarung oder konventionelle IVF-Techniken gewonnen wurden, in einer Kryoröhre zur späteren Lagerung vor und geben Sie 50 µL Embryo-Einfrierlösung EF S 40 hinzu. Bereiten Sie dann eine 35 mm oder 60 mm große Plastik-Petri-Schale mit 50 µL Raumtemperatur-EFS 20 vor.

Überführen Sie mit einer Glaskapillare bis zu 30 Embryonen in die Schale. Achten Sie darauf, das Kulturmedium nicht mitzuübertragen. Um eine Austrocknung der Embryonen zu gewährleisten, platzieren Sie sie am Boden des Tropfens.

Nach etwa 60 bis 90 Sekunden verwenden Sie ein Kapillarrohr, um dehydrierte Embryonen aufzusaugen, die eine geschrumpfte Morphologie aufweisen. Überführen Sie diese Embryonen in die EFS-Lösung im Kryoröhrchen, wobei möglichst wenig EFS 20 transferiert werden sollte.

Nachdem die Embryonen übertragen wurden, lassen Sie sie sich eine Minute lang in der EFS 40 absetzen, bevor sie in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Vor dem Auftauen der Embryonen geben Sie mindestens zwei Tropfen mit je 10 Mikroliter hochosmolarem Embryokulturmedium, wie beispielsweise M 16 Medium, in eine Kulturschale. Bedecken Sie die Tropfen anschließend vollständig mit Silikon- oder Mineralöl und stellen Sie die Schale bis zur Verwendung in einen Kohlendioxid-Inkubator.

Als Nächstes erwärmen Sie die TS-One-Lösung unter Verwendung einer Gesichtsmaske und Kryohandschuhe auf 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie die Embryonen aus dem flüssigen Stickstoffbehälter. Öffnen Sie nun schnell das Kryoröhrchen und entsorgen Sie jeglichen flüssigen Stickstoff in den Behälter oder einen geeigneten Auffangbehälter.

Dann 30 Sekunden warten. Nun 850 µL der warmen TS-eins-Lösung in das Kryoröhrchen geben. Die Lösung etwa 10-mal vorsichtig aufsaugen und wieder ausstoßen, damit sie gleichmäßig gelöst wird.

Überführen Sie dann das gesamte Volumen in eine plastische 60 Millimeter große Petrischale. Oder lassen Sie die Embryonen auf einer Uhrglasunterlage drei Minuten lang auf Raumtemperatur akklimatisieren, bei der sie für den Rest des Verfahrens verbleiben sollten. Verwenden Sie kein Erwärmungsgerät.

Untersuchen Sie die Embryonen in der Petrischale unter einem Stereomikroskop, um ihr Aussehen zu Beginn der Inkubation zu beurteilen. Nach etwa zwei Minuten Inkubation versenken Sie die Embryonen, indem Sie die Schale vorsichtig schütteln, bis das Medium gleichmäßig über die Oberfläche verteilt ist. In der letzten Minute der Inkubation geben Sie drei separate Tropfen je 50 Mikroliter TS-two-Lösung in die Schale ab.

Wenn die drei Minuten abgelaufen sind, verwenden Sie ein Stereomikroskop, um zu überprüfen, ob die Embryonen leicht geschrumpft sind. Falls die Embryonen noch geschwollen sind, fahren Sie mit der Inkubation für weitere ein bis drei Minuten fort. Heben Sie nun die Embryonen mit einer Glaskapillare auf und überführen Sie sie in den ersten Tropfen TS zwei.

Warten Sie drei Minuten und überführen Sie die Embryonen in den zweiten Tropfen. Danach in den dritten Tropfen. Schließlich holen Sie die vorbereitete Embryonenmediumschale aus dem Inkubator und überführen die Embryonen mit einer Glaskapillare in den ersten Tropfen des Mediums.

Unter einem Stereomikroskop betrachtet, sollten die Embryonen langsam ihre normale Morphologie zurückgewinnen. Stellen Sie die Petrischale nun etwa 10 Minuten lang in den Inkubator zurück. Anschließend wird die Saccharose ausgespült, die aus TS zwei übertragen wurde.

Versetzen Sie die Embryonen in den nächsten Tropfen Kulturmedium. Kultivieren Sie die Embryonen weiterhin im CO2-Inkubator, bis sie in die Uterus der empfänglichen Weibchen transferiert werden. Nach der Vitrifizierung und Wiedererlangung von 300 bis 480 Embryonen aus drei verschiedenen Mausstämmen war die Überlebensfähigkeit sehr hoch.

Nach dem Auftauen lag der Anteil der Embryonen mit normaler Morphologie zwischen 93 und 99 %, und mindestens 84 % dieser Embryonen entwickelten sich zu Blastozysten. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit austretendem Stickstoff äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie Vorsichtsmaßnahmen, um direkten Kontakt zu vermeiden und die Exposition in geringer Distanz gegenüber austretendem Stickstoff zu minimieren. Stickstoff sollte stets unter Durchführung dieses Verfahrens entnommen werden.