Erstellen Transient Zelle Membranporen Mit einem Standard-Inkjet-Drucker

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe von Tintenstrahldruck vorübergehende Poren in Zellmembranen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein handelsüblicher Tintenstrahldrucker modifiziert wird. Im zweiten Schritt wird eine herkömmliche Druckertintenpatrone entleert und gereinigt, um die Zugabe der Bio-Tinte zu ermöglichen.

Anschließend werden die Zellen von Interesse in einer Lösung aus fluoreszenzmarkierten Aktin-Monomeren und PBS suspendiert, um die Bio-Tintenlösung herzustellen. Im letzten Schritt wird die Bio-Tinte mithilfe des modifizierten Druckers und der Kartusche auf Objektträger aufgedruckt. Letztendlich kann mittels Fluoreszenzmikroskopie gezeigt werden, dass die mit Fluor vier konjugierten G-Aktin-Monomere durch vorübergehende Membranporen in die gedruckten Zellen aufgenommen wurden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Transfektions- und Zellmikroinjektionsmethoden liegt darin, dass diese Drucktechnik einfach anzuwenden ist und eine hohe Zellviabilität ergibt. Obwohl diese Technik Einblicke in die Genetik ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Forschungsbereiche wie die Zellbiophysik und das Gewebeengineering in der Zellbiophysik anwendbar. Mithilfe dieser Technik lässt sich das Cytoskelett einer Zelle während der Zellmigration einfach beobachten.

Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich aus dem Wunsch heraus, Veränderungen in der Zytoskelettanordnung aufgrund von auf Zellen wirkenden Kräften sichtbar machen zu können. Entfernen Sie zunächst die Kunststoffklammern von der unteren Basis des Druckers und heben Sie dann langsam das obere Kunststoffgehäuse ab. Trennen Sie anschließend die Anzeigeleuchte des Buttons von der Oberseite des Druckers, wobei sie weiterhin mit dem Motherboard des Druckers verbunden bleibt.

Unter Verwendung von Kim-Tüchern und Ethanol. Reinigen Sie das Innere des Druckers, insbesondere die Bereiche, in denen die Tintenpatrone ruht und wo der Druckvorgang stattfindet. Suchen Sie anschließend das Kabel, das die Papierzuführmechanik des HP DeskJet 500 mit Strom versorgt.

Sie befinden sich direkt unter dem Papierfach auf der linken Seite der Vorderseite; ziehen Sie nun die Kabel von der Hauptplatine ab. Suchen Sie anschließend den Papiererkennungsmechanismus und befestigen Sie eine Drahtschlaufe an dem grauen Kunststoffhebel, der oberhalb und hinter dem Papierzuführmechanismus angebracht ist, um als manueller Griff zu dienen; platzieren Sie hier eine Plattform. Der Schaumstoff-Transporthalter für 15 Zentrifugenröhrchen wird zusammen mit mehreren Mikroskopobjektträgern verwendet, die mit Klebeband an der Druckposition im Bereich vor dem Papierzuführmechanismus befestigt sind, um die gewünschten Druckobjektträger auf eine Höhe direkt unterhalb des Druckkopfes der Kartusche zu bringen.

Um schließlich die aseptische Technik beizubehalten, stellen Sie den Drucker in eine laminare Luftströmungskabine. Beginnen Sie damit, die Kartusche aus der Verpackung zu nehmen, wobei das Schutzband, das die Druckerkontakte und den Druckkopf bedeckt, belassen wird. Stabilisieren Sie den Kartuschenkörper mit einer Klammer, sodass die grüne Oberseite frei von Hindernissen bleibt, unter Verwendung eines handgeführten rotierenden Schneidwerkzeugs.

Schneiden Sie die grüne Abdeckung der Kartusche ab, leeren Sie die restliche Tinte aus dem Reservoir und entfernen Sie anschließend das Schutzfolie aus Kunststoff, die die Druckerkontakte und den Druckkopf bedeckt. Dabei kann Wasser aus dem Druckkopf austreten, was der Kartusche jedoch keinen Schaden zufügt. Wenn das ablaufende Wasser klar ist, lassen Sie die Kartusche trocknen.

Um eine saubere Druckumgebung zu gewährleisten, tauchen Sie die Kartusche zunächst vollständig in einen Becher mit entionisiertem Wasser ein und behandeln Sie sie 15 Minuten lang mit Ultraschall. Nach der Ultraschallbehandlung nehmen Sie die Kartusche heraus und schütteln das überschüssige Wasser ab. Sprühen Sie 70 % Ethanol in die Kartusche, um eine bessere aseptische Umgebung zu schaffen.

Nach der Gewinnung der gewünschten Zellen zentrifugieren Sie die Zellen in fünf Milliliter frischem Medium in einem 15-Milliliter-Konischzentrifugenröhrchen fünf Minuten lang bei 250 × g bei Raumtemperatur. Danach aspirieren Sie das Medium und resuspendieren die Zellen in frisch zubereiteter fluoreszenter G-Aktin-Standardlösung bei einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro Milliliter. Um die Bio-Tinte herzustellen, beachten Sie, dass 250 Mikroliter Bio-Tinte drei Deckgläser mit dem hier gezeigten Linienmuster bedrucken. Nachdem der Drucker eingeschaltet und aufgewärmt wurde, platzieren Sie die gewünschte Druckoberfläche hier; 22 Millimeter × 22 Millimeter große Deckgläser werden in die Mitte der zuvor montierten Halterung gelegt.

Öffnen Sie als Nächstes ein Zeichenprogramm und wählen Sie das gewünschte Muster aus. Pipettieren Sie nun etwa 100 bis 120 Mikroliter der Zellsuspension in das kleine runde Bohrloch am Boden des Kartuschenfachs. Drucken Sie die Datei aus, während sich der Drucker erneut aufwärmt; dabei bewegt sich die Kartusche in die Bereitschaftsposition.

Wenn sich die Kartusche leicht links von der Tintenaustrittsöffnung bewegt und dort verharrt, ziehen Sie am Papierzuführmechanismus nach oben, woraufhin der Draht und der Druckvorgang starten. Der Drucker druckt auf den Deckgläsern, die in der Mitte der Druckplattform platziert sind, unter Verwendung eines HP Deskjet 500 Druckers mit einer Bio-Tinte, die aus einer Fibroblastenzellsuspension in einer G-Aktin-Monomerlösung besteht.

In einer HP 26-Serie wurden Tintenpatronenzellen auf Glasobjektträgern aufgebracht. Diese Abbildung zeigt ein repräsentatives Ergebnis aufgebrachter Fibroblastenzellen, die fluoreszierende Aktin-Monomere eingebaut haben. Dieses Muster wurde in der vorherigen Abbildung verwendet, um eine durchgehende Linie der Auftragslösung über den größten Teil des Objektträgers zu erzeugen.

In dieser Abbildung ist die gerade Linie dargestellt, entlang derer Biolink und Zellen gemeinsam abgeschieden wurden. Beachten Sie, dass unmittelbar nach dem Drucken die Hintergrundfluoreszenz ansteigt, da die Biolink-Lösung, in der die Zellen suspendiert sind, freie überschüssige fluoreszierende Aktin-Monomere enthält. Eine Inkubation der Zellen für etwa 10 Minuten nach dem Drucken fördert die Adhäsion an dem Objektträger und ermöglicht es, die überschüssige Monomerlösung durch frisches Wachstumsmedium vom Substrat zu waschen, wodurch die Hintergrundfluoreszenz deutlich verringert wird. Hier ist ein repräsentatives Bild von drei T3-Fibroblasten, die in einer lokalisierten Druckzone gedruckt wurden. Wie dieses fluoreszenzmikroskopische Aufnahmefoto einer Zelle 15 Minuten nach dem Drucken zeigt, erscheint F-Aktin grün, der Zellkern blau und die Überlagerung beider, des G-I-Aktins und des Kernfarbstoffs.

Die nächsten beiden Bilder zeigen die Fluoreszenzmikroskopie von zwei Fibroblasten in einem Linienmuster drei Stunden nach dem Druck. Dieses erste Bild zeigt fluoreszenzmarkierte Aktin-Monomere innerhalb der Zellen. Dieses zweite Bild ist eine Überlagerung des Fluoreszenzkanals mit dem Hintergrundbild und zeigt, dass, obwohl etwas Trümmermaterial auf der Objektträgerfläche in der unteren linken Ecke vorhanden sein mag, dieses nicht fluoresziert.

Als Kontrollgruppe werden hier nicht gedruckte Zellen gezeigt, die drei Stunden mit fluoreszenzmarkierten Monomeren inkubiert wurden, um zu demonstrieren, dass Monomere ohne Membranpermeabilisierung durch das Zell-Druckverfahren nicht in die Zelle eindringen können. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, mehrere gereinigte Kartuschen bereitzuhalten, da Verstopfungen der Druckdüsen eines der Probleme sind, die diese Technik verlangsamen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie ein handelsüblicher Tintenstrahldrucker für den Druck lebender Zellen umgerüstet werden kann, was zur Erzeugung transiente Membrankräfte beiträgt.