Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Schicksalskartierung und Linienträgung ausgewählter einzelner Zellen in Zebrafischembryonen durchzuführen. Dies wird erreicht, indem fluoreszein chemisch an Dextran mit hohem Molekulargewicht gekoppelt wird. Anschließend wird das hergestellte cagete Fluoreszein-Dextran in Zebrafischembryonen mikroinjiziert und mittels Zwei-Photonen-Absorption in ausgewählten Zellen photoaktiviert.

Nach der photochemischen Aktivierung der Embryonen wird eine immunhistochemische Analyse durchgeführt, um das freigesetzte Fluorescein-Dextran nachzuweisen und so die Aktivierung der Zellen der Linie zuzuordnen. Letztendlich kann mit dieser Methode der Beitrag einzelner Zellen zur Zelllinie sowie deren Gewebelokalisation bestimmt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden, wie der Standard-Fluoreszenzmikroskopie, liegt darin, dass einzelne Zellen unterschiedlich markiert werden können, um eine verlässliche Linienverfolgung durchzuführen.

Diese Methode kann uns helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise wie undifferenzierte Vorläuferzellen zu verschiedenen Gewebetypen beitragen können. Eine visuelle Demonstration ist entscheidend, da die Schritte zum Montieren des Embryos und zur photochemischen Aktivierung allein anhand einer Textbeschreibung nur schwer zu erlernen sind. Bevor Sie beginnen, synthetisieren Sie fluoresceinmarkiertes Dextran mit Schutzgruppe und lagern Sie es in mit Metallfolie umwickelten Röhrchen. Anschließend injizieren Sie die Embryonen im Ein- bis Zweizellstadium mikroinjektorisch mit dem synthetisierten caged Fluorescein-Dextran.

Nachdem die Embryonen den geeigneten Entwicklungsstand erreicht haben, beschichten Sie diese. Danach montieren Sie die beschichteten Embryonen in niedrig schmelzendem Agarose für die Photoaktivierung. Sobald die Agarose erstarrt ist, laden Sie die LSM 510-Software.

Platzieren Sie einen transparenten gelben Filter im Strahlengang des weißen Lichts und wählen Sie anschließend „neues Bild scannen“ und klicken Sie auf „Expertenmodus starten“. Wählen Sie den Laser-Tab, schalten Sie die Argon-Eisen- und die Mi-Tai-Laserquellen ein. Stellen Sie die Mi-Tai-Wellenlänge auf siebenhundertvierzig Nanometer ein.

Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte „Config“ aus. Stellen Sie die optischen Pfadkonfigurationen für das Argon-Ion und den Mi Tai-Laser ein. Wählen Sie dann die Registerkarte „Scan“ aus.

Wechseln Sie das Objektiv auf 20×0,8. Stellen Sie die maximale Scan-Geschwindigkeit ein, indem Sie unter der Registerkarte „Kanäle“ den Maximalmodus auf „Set Method“ und die Zahl auf „Line Mean“ bzw. „Eins“ setzen und alle Laserquellen mit Ausnahme des Mi Tai deaktivieren. Bringen Sie danach ein Leistungsmessgerät in den optischen Strahlengang an und wählen Sie die Schaltfläche „Con“, um das kontinuierliche Scannen zu aktivieren.

Stellen Sie den Transmissionsprozentsatz so ein, bis das Leistungsmessgerät eine durchschnittliche Laserleistung von 47 Milliwatt anzeigt. Stoppen Sie dann den Scan, indem Sie die Schaltfläche „Stop“ unter der Registerkarte „Channels“ auswählen. Deaktivieren Sie die Mi-Tai-Laserquelle und aktivieren Sie das Argonne-Eisen.

Danach erneut die Schnell-XY-Schaltfläche unter der Registerkarte Kanäle auswählen und die Lochblende anpassen. Verstärkung, Offset-Verstärkung und erneute Verstärkung für den Argonne-Eisenlaser einstellen, um die beste Bildqualität zu erzielen. Mithilfe des Bühnenreglers die zu aktivierende Zelle finden und fokussieren, dann auf die Stopp-Schaltfläche klicken. Mit dem Zuschneidewerkzeug die aktivierte Zelle zuschneiden, sodass unter der Registerkarte Modus ein Zuschneide-Faktor von 50 bis 70 angezeigt wird.

Stoppen Sie dann den Scan, indem Sie die Schaltfläche „Stop“ unter der Registerkarte „Kanäle“ auswählen. Deaktivieren Sie den Argon-Ionenlaser und wählen Sie den My-Tai-Laser unter der Registerkarte „Modus“. Stellen Sie die Scan-Geschwindigkeit auf 31,46 Sekunden ein.

Danach die einzelne Schaltfläche auswählen, um den Scan zur Zwei-Photonen-Aktivierung des cagierten Fluorescein-Dextrans der ausgewählten Zelle zu starten. Nach der Aktivierung zum Reiter „Kanäle“ wechseln und nun den Mi-Tai-Laser abwählen und den Argon-Ionen-Laser erneut auswählen. Anschließend unter „Modus“ den Zoomfaktor auf eins einstellen. Weiter.

Unter der Überschrift Geschwindigkeit klicken Sie auf die Schaltfläche „max“, um die höchste Scan-Geschwindigkeit einzustellen. Um den fotoaktivierten Bereich zu überprüfen, wählen Sie „schnell xy“. Danach wählen Sie den Reiter „Kanäle“ aus, passen die Lochblende an und detektieren erneut; stellen Sie sicher, dass der fotoaktivierte Bereich nicht durch Laserablation beschädigt wurde.

Nach der Vorbereitung der lichtaktivierten Embryonen zur Immundetektion von freigesetztem Fluorescein-Dextran gemäß dem im begleitenden Manuskript beschriebenen Protokoll. Waschen Sie die Embryonen sechsmal in PBT und zweimal in AP-Puffer. Anschließend überführen Sie die Embryonen in Neunmuldenplatten in AP-Puffer.

Als Nächstes den AP-Puffer abpipettieren und N-B-T-B-C-I-P hinzufügen. Die Entstehung der N-B-T-B-C-I-P-Färbung beenden, indem die N-B-T-B-C-I-P-Lösung abpipettiert wird. Anschließend die Embryonen in PBT waschen.

Jetzt die Embryonen gewinnen und sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Plattform schütteln. Anschließend die Wäsche mit PBT noch zweimal wiederholen. Schließlich die Embryonen in 0,6 % Low-Melting-Agarose einbetten und Bilder der photoaktivierten Zellen mithilfe eines aufrechten zusammengesetzten Mikroskops aufnehmen.

In dieser Abbildung ist links ein Hellfeldbild und rechts ein Fluoreszenzbild eines mikroinjizierten Zebrafischembryos mit cagiertem Fluorescein-Dex-Strang vor der Photoaktivierung dargestellt. Wie hier gezeigt, wurde der Embryo in einem der Somiten, die durch den Pfeil im linken Hellfeldbild markiert sind, mit einer Wellenlänge von 740 Nanometern, einer Scanzeit von 31 Sekunden und einer durchschnittlichen Laserleistung von 47 Milliwatt photoaktiviert. Im rechten Bild ist nach der Photoaktivierung die Fluoreszenz des entcagierten Fluorescein-Dextrans in dieser Abbildung sichtbar.

Die Immunfärbung von freigesetztem Fluorescein-Dextran zeigt einen kleinen Bereich in der Seitenplatte, Mesoderm eines 10 Stunden alten Embryos, der mit denselben Laserparametern wie in der vorherigen Abbildung unter Verwendung des Immunodetektionsverfahrens photoaktiviert wurde. Der hier durch den Pfeil markierte aktivierte Bereich kann nach diesem Verfahren mit minimalem Hintergrundsignal identifiziert werden.

Zusätzliche Analysen, wie beispielsweise Immunfärbungen für verschiedene gewebespezifische Marker, können durchgeführt werden, um den Ort und das Schicksal markierter Zellen besser zu charakterisieren. Mit dieser Technik eröffnet sich für Forscher im Bereich der Gefäßbiologie die Möglichkeit, den Ursprung arterieller und venöser Vorläuferzellen in sich entwickelnden Zebrafischembryonen zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass chemische Reagenzien wie NBT und BCIP äußerst gefährlich sein können und stets Handschuhe getragen werden sollten.