Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Die in diesem Video gezeigte Methode nutzt Fate-Maps des Furchungsstadiums des Opus-Embryos, um einzelne Blasterkulturen isoliert zu identifizieren, um zu untersuchen, ob die embryonale Sulfatbildung durch intrinsische oder extrinsische Signale bestimmt wird. Zunächst werden Zweizellen-Embryonen gesammelt, bei denen die erste Furchungsfurche den leicht pigmentierten Bereich der animalen Hemisphäre teilt. Diese Embryonen werden kultiviert, bis sie 16 bis 32 Zellen erreichen. Dann wird die Vitellinmembran entfernt und benachbarte Zellen von der ausgewählten Zelle abdisseziert. Als Beispiel wird der isolierte Blaster anschließend in eine Vertiefung einer mit Auger beschichteten Kulturmulde überführt und kultiviert.

Wenn das Explant das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht hat, wird es entnommen, um die Gen- oder Proteinexpression mittels In-situ-Hybridisierung, qPCR oder Immunhistochemie zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen, wie der Kultivierung großer Gruppen embryonaler Zellen oder Organe im Anmeldeprozess, liegt darin, dass einzelne embryonale Zellen, deren Entwicklungsschicksal aus Linientracing-Studien bekannt ist, kultiviert werden können, ohne dass zusätzliche Wachstumsfaktoren oder benachbarte Zellen vorhanden sein müssen. Somit kann direkt geprüft werden, ob Faktoren, die der Zelle intrinsisch sind, diese dazu anleiten, die Vorläuferzelle eines bestimmten Gewebes zu werden, oder ob sie Signale von umgebenden Zellen benötigt.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Dissektion von Blairs und deren Übertragung in Kulturmulden empfindliche Handgriffe unter dem Stereomikroskop erfordern. In diesem Video werde ich diese Methode verwenden, um zu demonstrieren, ob mütterliche mRNA-Moleküle die Zellen in Richtung einer neuralen Zelllinie beeinflussen. Arbeiten Sie unter dem Dissektionsmikroskop. Schärfen Sie vier Paar Pinzetten mit Hilfe von Illumina-Schleiffolie.

Ein Paar Pinzetten dient als Ersatz, falls eine Spitze während des Eingriffs beschädigt wird; autoklavieren Sie alle vier Pinzetten und lagern Sie sie in einem sterilen Behälter. Stellen Sie jeweils 500 Milliliter 0,1 x und 1,0 x modifiziertes Barth-Salz (MBS) her und filtrieren Sie zur Sterilisation. Lagern Sie diese Lösungen monatelang bei 14 bis 18 Grad Celsius in einer Glasflasche mit Schraubverschluss. Bereiten Sie 2 % Elektrophorese-Grad-Agarose in 100 Milliliter 1 x Kulturmedium vor, autoklavieren Sie zur Auflösung der Agarose und erwärmen Sie im Mikrowellenofen, um die Agarose bei nächster Verwendung zu verflüssigen, solange sie flüssig ist.

Geben Sie etwa 0,5 Milliliter auf den Boden jedes Wells einer sterilen 24-Well-Kulturplatte. Dies verhindert, dass die Implantate an dem Kunststoff haften. Geben Sie anschließend etwa zwei bis drei Milliliter auf den Boden von zwei bis drei 60-Millimeter-Petri-Schalen und schwenken Sie sie vorsichtig, um die Flüssigkeit zu verteilen.

Diese dienen als Präparierschalen, und das Aros verhindert, dass die Embryonen an dem Kunststoff haften. Nachdem ihre Membranen entfernt wurden, wenn das Aros abgekühlt und erhärtet ist, erhitzt die Spitze einer sechs Zoll langen Pasteurpipette, bis sie zu einer Kugel schmilzt. Kühlt die Kugel kurz ab und berührt sie dann leicht auf der Oberfläche des Aros in einer Vertiefung der Kulturplatte.

Dadurch entsteht eine flache Vertiefung, in die das X-Explan gelegt wird. Wiederholen Sie dies für jedes Loch in der Platte. Füllen Sie anschließend jedes Loch der Kulturplatte mit einem Milliliter eines x-sterilen Kulturmediums.

Füllen Sie dann die Dissektionschale mit 0,1 × MBS, um die Trennung der Blastomeren zu erleichtern. Sobald die Dissektionschalen vorbereitet sind, überführen Sie befruchtete Eier ohne Eigele zu 100 Millimeter Petrischalen, die 0,5 × Kulturmedium enthalten. Diejenigen, die nicht sofort verwendet werden, können bei 14 Grad Celsius kultiviert werden, während die erste Schale auf Zweizellen-Embryonen untersucht wird.

Untersuchen Sie die Embryonen in der ersten Petrischale mithilfe eines Stereomikroskops und überführen Sie mit einer Plastik-Transferpipette etwa 10 Ein-Zell- und Zweizellembryonen in eine separate Schale, die mit 0,5 x Kulturmedium gefüllt ist. Stellen Sie die Petrischale in einen Inkubator bei 14 Grad Celsius. Die Fähigkeit dieses Assays, das Entwicklungspotential einer Zelle genau einzuschätzen, hängt davon ab, dass der korrekte Keimblattbereich basierend auf Fate-Maps präpariert wird.

Daher ist es entscheidend, Embryonen mit dem korrekten Pigmentierungsmuster im Zweizellstadium auszuwählen, die anschließend regulären Teilungsmustern folgen. Wie hier veranschaulicht. Regelmäßige Teilungen treten häufig nur auf einer Seite des Embryos auf.

Diese Embryonen können weiterhin als Spender verwendet werden, wenn die Spenderzelle von der regulären Seite stammt. Wenn die Embryonen das Zweizellstadium erreichen, sortieren Sie jene, bei denen die erste Teilungsfurche den leicht pigmentierten Bereich in der animalen Hemisphäre durchschneidet, in eine separate Schale; sortieren Sie etwa fünfmal so viele Embryonen wie später disseziert werden. Diese werden die Spender für das Explan darstellen.

Die verbleibenden Zweizellen-Embryonen während des gesamten Verfahrens in einer separaten Schale neben den Donorembyryonen aufbewahren, um als Geschwisterkontrollen zur Stadieneinteilung des Explantats zu dienen. Nachdem die Embryonen sortiert und disseziert wurden, kehren Sie zu den Schalen im Inkubator zurück, um weitere Ein- und Zweizellen-Embryonen zu finden. Da es etwa 90 Minuten dauert, bis sich Einzellen-Embryonen teilen, kann dies bis zu zwei Stunden nach der Eiersammlung erfolgen.

Um das Explantat vorzubereiten, geben Sie fünf bis zehn Embryonen in eine Dissektionschale. Positionieren Sie dann den ersten Embryo so, dass die durchsichtige Vitellinmembran mit der Pinzette erfasst werden kann. Diese ist normalerweise nicht sichtbar, kann aber am Animalpol erfasst werden, wo sie durch einen klaren perivitellinen Raum von der Oberfläche des Embryos getrennt ist.

Greifen Sie mit einer geschärften Pinzette in der einen Hand in einigem Abstand vom zu präparierenden Bläser an, um diesen nicht zu beschädigen. Greifen Sie dann mit der anderen, ebenfalls geschärften Pinzette die Membran nahe der Spitze der ersten Pinzette und ziehen Sie vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen, um die Membran abzulösen. Das Embryo wird sich abflachen, sobald die Membran entfernt wurde.

Nehmen Sie anschließend eine benachbarte Zelle mit der Pinzette auf und verwenden Sie diese Zelle als Griff, sodass die zu dissezierende Zelle nicht direkt mit der anderen Pinzette berührt wird; ziehen Sie vorsichtig die übrigen benachbarten Zellen von der gewünschten Zelle weg. Falls Mittellinienzellen, die dasselbe Schicksal teilen, im Fokus stehen, können diese gemeinsam als Paar entfernt werden. Schließlich dissezieren Sie die Griffzelle ab.

Heben Sie das Blastozysten- oder Amere-Paar mit einer sterilen Glas-Pasteur-Pipette auf, wobei Sie Luftblasen und übermäßiges Ansaugen vermeiden. Führen Sie die Spitze der Pasteur-Pipette unter die Oberfläche des Kulturmediums in einer Vertiefung der X-explan-Kulturschale ein und geben Sie vorsichtig die Blastozyste frei. Diese sollte durch die Schwerkraft in die flache Vertiefung gleiten.

Blasphemer aus mehreren Embryonen können zu einem einzigen Explan kombiniert werden, indem sie in dieselbe Vertiefung einer Kultur gegeben werden. Wir wiederholen diesen Vorgang nacheinander mit den verbleibenden Embryonen in der Präparierschale. Nach etwa 10 Embryonen wird die Präparierschale mit zellulärem Abfallmaterial gefüllt sein.

Wenn dies der Fall ist, wechseln Sie zur nächsten Präparierschale. Nachdem alle Präparationen abgeschlossen sind, überprüfen Sie, ob sich die Explantate in den flachen Vertiefungen befinden. Andernfalls können sie vorsichtig mit einer Haarschleife in die Vertiefung geschoben werden, die zuvor mit 70 % Ethanol sterilisiert und luftgetrocknet wurde. Inkubieren Sie die Implantate etwa eine Stunde nach der letzten Präparation bei Raumtemperatur auf dem Laborpult.

Entfernen Sie Schmutzpartikel um das geheilte Explant herum mit einer sterilen Glas-Pasteurpipette. Stellen Sie die Platte mit dem Explant bei 14 bis 20 Grad Celsius neben die Petrischale, die die Geschwisterkontroll-Embryonen enthält. Die Geschwister-Embryonen zeigen das Entwicklungsstadium des Explants an.

Nach etwa ein bis zwei Stunden in Kultur haben die ausgesiedelten Blastomeren sich etwa viermal geteilt und den Großteil des von beschädigten benachbarten Zellen stammenden Abfalls abgestoßen. Nach 20 Stunden bilden sie kleine, stabile Zellhaufen. Wenn die Geschwisterzellen den gewünschten Entwicklungsstand erreicht haben, gewinnen Sie das Explantat.

Diese Explantate überleben ziemlich gut, selbst wenn einige der Zellen zerfallen. Wenn daher eine trübe Masse in der Kultur vorhanden ist, untersuchen wir sie mit einer Haarschleife oder einer Pinzette, um festzustellen, ob sich ein gesundes Explantat darin befindet. Das Explantat wird mit einer Glas-Pasteurpipette in einem kleinen Volumen Kulturmedium aufgenommen und vorsichtig in ein für den jeweiligen Assay geeignetes Fixiermittel oder Lysepuffer überführt.

Zwei dorsale Blastomere oder zwei ventrale Blastomere wurden im 16-Zell-Stadium disseziert und gemeinsam in einem XMBS bei 14 Grad Celsius kultiviert, bis die Geschwisterembryonen frühe Neuralplattenstadien erreichten. Jede Probe wurde auf die Expression eines zygotischen Neuralplatten-Gens Sox2 mittels In-situ-Hybridisierung analysiert, die als blauer Reaktionsprodukt sichtbar ist.

Die Ergebnisse dieses Assays zeigen, dass der Großteil der dorsalen animalen Blastomeren, die Vorläufer der Neuralplatte sind, SOX2 autonom exprimieren kann, das heißt ohne zusätzliche Signalgebung aus anderen Regionen des Embryos. Diejenigen Exemplare, die SOX2 nicht exprimieren, könnten zum Zeitpunkt der Dissektion fälschlicherweise identifiziert worden sein.

Im Gegensatz dazu exprimieren keine der ventralen animalen Bläschen, die Vorläufer des ventralen Epidermis sind, SOX2. Diese Daten deuten darauf hin, dass dorsale animale Bläschen eine intrinsische Fähigkeit besitzen, Nervengewebe zu bilden, während die ventralen animalen Bläschen dies nicht tun. Einige der dorsal gelegenen Explants weisen außerdem eine verlängerte Morphologie auf, die auf die Bildung von dorsalem Mesoderm hindeutet.

Diese Blastomere verfärben sich ebenfalls, um den Noor im intakten Embryo zu bilden, und eine Explan-Kultur exprimiert ein Noor-Markerprotein, um den Effekt der Veränderung der endogenen Spiegel eines mütterlich exprimierten neuronalen Gens zu testen. Fox D fünf-mRNAs wurden in die Blastomere der achtzelligen ventralen Vorläufer injiziert. Wie hier gezeigt, exprimierte die Mehrheit der ventralen Implantate SOX zwei.

Umgekehrt wurde, wenn der endogene Spiegel von Fox D fünf durch Injektion von Antisense-Morpholino-Oligonukleotiden in die acht Zellen umfassenden dorsalen Vorläuferblastomere reduziert wurde, nur in wenigen dorsalen Explantaten SOX zwei exprimiert. Diese Experimente zeigen, dass die mütterliche Expression von Fox D fünf eine Rolle bei der intrinsischen Fähigkeit dorsaler Blastomere spielt, vor diesem Verfahren ein neuronales Schicksal anzunehmen. Weitere Methoden, wie beispielsweise die Injektion in die zu dissezierenden Blastomere von mRNAs zur Untersuchung von Funktionserhalt oder Antisense-Morpholino-Oligonukleotiden zur Untersuchung von Funktionsverlust, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten.

Zum Beispiel, welche Gene sind an der intrinsischen Fähigkeit von Zellen beteiligt, ein bestimmtes Entwicklungsschicksal hervorzurufen? Außerdem können bekannte Signalstoffe getestet werden, indem gereinigte Faktoren dem Kulturmedium zugesetzt werden. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um einzelne Zellen an neuartige Positionen im intakten Embryo zu transplantieren.

Dieser Test prüft, ob die transplantierte Zelle ihrem ursprünglichen Entwicklungsschicksal verpflichtet ist; diese Information ist entscheidend, um die zellulären Mechanismen zu definieren, durch die eine pluripotente embryonale Zelle zur Vorläuferzelle eines definierten Gewebes wird.