Cut-loading: ein nützliches Werkzeug für die Prüfung des Umfangs der Gap Junction Tracer Kopplung zwischen Netzhautneuronen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Schnitt-Lade-Experiments besteht darin, das Ausmaß der Gap-Junction-Tracer-Kopplung zwischen Neuronen in der intakten Netzhaut unter kontrollierten Beleuchtungsbedingungen zu untersuchen. Im ersten Schritt werden Netzhäute mit einer scharfen Klinge geschnitten, die in eine Lösung aus Neurobiotin, einem Tracermolekül, das durch offene Gap-Junction-Kanäle, jedoch nicht durch Zellmembranen diffundieren kann, getaucht wurde. Im zweiten Schritt werden die Netzhäute in Ringer-Lösung inkubiert, wodurch die Diffusion des Tracers durch offene Gap-Junction-Kanäle ermöglicht wird.

Wenn die Gap-Junction-Kopplung schwach ist, bleibt die Neurobiotin-Fluoreszenz auf Netzhautneuronen beschränkt, die nahe dem Schnitt liegen. Im Gegensatz dazu wird die Fluoreszenz bei starker Gap-Junction-Kopplung in Netzhautneuronen weit entfernt vom Schnitt nachgewiesen. Der Hauptvorteil der Schnittbeladung gegenüber bestehenden Techniken besteht darin, dass sie leichter an Neuronen mit kleinen Zellkörpern im intakten neuralen Netzhautgewebe durchzuführen ist.

Es ist außerdem einfacher, die Beleuchtungsbedingungen während der Schnittbeladung zu kontrollieren als während einer elektrophysiologischen Untersuchung einzelner Neuronen im intakten Netzhautgewebe. Da die Lichtreize, die während der elektrischen Aufzeichnung verwendet werden, selbst zu Veränderungen in der Gap-Junction-Kopplung führen können, wird die Technik von Dr. Chu Choi, einem Postdoktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Bei diesem Verfahren wird ein Goldfisch vor der Operation tagsüber mindestens eine Stunde lang in konstantem Dunkel gehalten, und alle folgenden Schritte bis zur Fixierung des Netzhautgewebes werden ebenfalls tagsüber im konstanten Dunkel durchgeführt; der Goldfisch wird tief anästhesiert, indem 150 Milligramm pro Liter Methansulfonat dem Aquarienwasser zugesetzt werden.

Anschließend die Goldfische gemäß den bundesstaatlichen und universitären Richtlinien töten und die Augäpfel vorsichtig entfernen. Danach den vorderen Teil jedes Augapfels entfernen. Anschließend ein Stück Filterpapier auf den hinteren Teil des Auges legen und das Filterpapier zusammen mit dem Auge umdrehen, sodass sich das Filterpapier unterhalb des hinteren Teils des Auges befindet.

Entfernen Sie nun vorsichtig die Augenhinterseite einschließlich der Sklera und des Pigmentepithels von der dunkeladaptierten Goldfisch. Retina durchtrennen Sie den Sehnerv mit einer feinen Schere. Die isolierte Netzhaut des Goldfisches, mit der Photorezeptorseite nach oben ausgerichtet, sollte vor der Enukleation an dem Filterpapier befestigt sein, während der Fisch unter Narkose steht, in fünf Milliliter sauerstoffhaltiger, carbonathaltiger Ringer-Lösung mit oder ohne Testsubstanz pro Vertiefung einer sechs-well-Platte nach der Präparation der intakten neuralen Netzhaut aus dem hinteren Augenabschnitt.

Überführen Sie die Netzhäute während konstanter Dunkelheit in die Vertiefungen. Versiegeln Sie anschließend die Vertiefungen mit Paraform und lassen Sie das Gewebe 30 Minuten inkubieren. Bereiten Sie 100 Mikroliter Tracerlösung vor, indem Sie 0,5 % Neurobiotin unmittelbar vor dem Durchschneiden der Netzhaut in Ringer-Lösung auflösen.

Fügen Sie als Nächstes die Neuro-Biotin-Lösung einer Glas-Petrischale hinzu. Dann klopfen Sie vorsichtig das Filterpapier, an dem die Retina befestigt ist, auf ein Papierhandtuch, um überschüssiges Ringer-Lösung zu entfernen. Tauchen Sie eine Rasierklinge in die Neuro-Biotin-Lösung und führen Sie damit einen senkrechten radialen Schnitt durch die Retina und das Filterpapier.

Danach tauchen Sie die Rasierklinge erneut in die Neuro-Biotin-Lösung und schneiden die Netzhaut ein zweites Mal. Wiederholen Sie dies bis zu viermal pro Netzhaut. Überführen Sie die Netzhaut in diesem Schritt in frisches Ringer-Medium mit oder ohne Testsubstanz für 15 Minuten, um das Beladen und die Diffusion zu ermöglichen.

Waschen Sie sie dreimal mit frischem Ringer-Medium, mit oder ohne Testsubstanz, jeweils fünf Minuten lang. Anschließend fixieren Sie die Netzhaut mit 4 % Paraformaldehyd in 0,1-molarer Phosphatpufferlösung bei Raumtemperatur für eine Stunde. Danach waschen Sie die Netzhaut über Nacht mit 0,1-molarer PBS bei vier Grad Celsius, indem Sie sie am folgenden Tag in einen Kühlschrank stellen.

Reagieren Sie die Netzhaut mit 2 % Streptavidin-Alexa-488 in 0,1 molarem PBS und 0,3 % Triton X-100 auf eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag waschen Sie die Netzhaut dreimal mit 0,1 molarem PBS bei Raumtemperatur, jeweils zehn Minuten lang.

Lösen Sie die Netzhaut von dem Filterpapier in PBS ab. Bringen Sie die Netzhaut dann mithilfe eines feinen Pinsels mit der Photorezeptorseite nach oben auf einem Objektträger mit Vector-Shield-Montagemedium an. Übertragen Sie den Objektträger auf ein Laser-Scanning-Konfokalmikroskop und nehmen Sie Aufnahmen mit derselben Vergrößerung, Auflösung und Einstellungen für jede experimentelle Bedingung vor, um Vergleiche der Auswirkungen unterschiedlicher experimenteller Bedingungen auf das Ausmaß der Lückenfunktionstracer-Kopplung anstellen zu können, wie gezeigt.

Hier ist das Ausmaß der Kopplung von Fotorezeptorzelltracern während des Tages im konstanten Dunkel im Vergleich zum Tag im konstanten Dunkel in Gegenwart eines selektiven Dopamin-D2-Rezeptor-Antagonisten. Beachten Sie, dass der Rasierschnitt in beiden Bildern links ist. Obwohl ein einzelnes Bild alle markierten Zellen enthalten kann, wird empfohlen, einen Z-Stack des interessierenden Bereichs aufzunehmen und diesen zu einem einzigen Bild zusammenzufassen, wie gezeigt.

Hier ist das Ausmaß der Kopplung von Fotorezeptorzelltracern dargestellt, wenn man nacheinander einen solchen Zack durchläuft. Beachten Sie, dass der Rasiererschnitt auf der rechten Seite dieses Bildes liegt. Um das Ausmaß der Tracerkopplung im LSM-Bildbetrachter zu quantifizieren, öffnen Sie das Bild, klicken Sie dann auf „Exportieren“ und speichern Sie das Bild als nicht komprimierte TIF-Datei mit 16 Bit; die Maßstabsleiste sollte mithilfe der NIH-Image-J-Software in dieses TIFF-Bild eingefügt werden.

Messen Sie die Fluoreszenzintensität von Alexa 488-markiertem Neurobiotin anhand von Aufnahmen von retinalen Lochpräparaten mit niedriger Vergrößerung. Öffnen Sie die TIFF-Datei mit der ImageJ-Software und zeichnen Sie eine gerade Linie, die der Skalierungsleiste entspricht. Gehen Sie anschließend zu Analysieren, Skalierung festlegen und geben Sie die bekannte Distanz und Längeneinheit ein.

Dann klicken Sie auf „Okay“. Nun können die Fluoreszenzmessungen in kalibrierten Einheiten wie Millimeter dargestellt werden. Danach wählen Sie den interessierenden Bereich mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug aus.

Der Peak der Fluoreszenz sollte sich am linken Rand Ihrer Auswahl befinden. Stellen Sie sicher, dass sich in der Nähe des rechten Rands kein Fluoreszenzsignal befindet. Klicken Sie auf „Analysieren“ und „Profil plotten“ für die tagsüber erhaltenen Kontrolldaten unter konstanter Dunkelheit.

Eine Kurve mit exponentiellem Abfall wird von links nach rechts dargestellt. Klicken Sie dann im Popup-Fenster auf Kopieren und fügen Sie sie in Excel ein. Nun liegen zwei Spalten vor, von denen eine den Abstand zum Schnitt und die andere die Fluoreszenzintensität als Funktion des Abstands zum Schnitt anzeigt.

Zum Vergleich werden die obigen Schritte mit Daten wiederholt, die tagsüber unter konstanter Dunkelheit gewonnen wurden. In Gegenwart von Spit bro dividieren Sie jeden Rohfluoreszenzwert durch den maximalen Fluoreszenzwert, um die relative Fluoreszenzintensität zu erhalten. Kopieren Sie zwei Spalten, die der Entfernung vom Schnitt und der relativen Fluoreszenzintensität entsprechen, und fügen Sie diese anschließend in die Origin-Software ein.

Diese Schritte werden sowohl für die Tageskontrolle als auch für die Tagesprobe gezeigt. Passen Sie die Daten an diesem Punkt mit der exponentiellen Abnahme-Funktion an und vergleichen Sie die Werte der räumlichen Konstante unter verschiedenen experimentellen Bedingungen mithilfe eines T-Tests oder einer Inova.

Exponentielle Funktionen und statistische Analysen der Daten von Tageskontrollen, Tages-Pipron-Daten und Nachtkontrollen werden zum Vergleich gezeigt. Hier sind Beispiele für das Ausmaß der Kopplung von Fotorezeptorzelltracern in der dunkeladaptierten Goldfischretina am Tag A, in der Nacht B und tagsüber in Gegenwart eines selektiven Dopamin-D2-Rezeptor-Antagonisten, wie sie mit der Cut-Loading-Technik sichtbar gemacht wurden. Alle konfokalen Aufnahmen wurden unter identischen Einstellungen aufgenommen, um einen Vergleich zu ermöglichen.

In dieser Grafik wird die Fluoreszenzintensität für drei experimentelle Bedingungen als Funktion des Abstands vom Schnitt dargestellt und mittels einer exponentiellen Funktion angepasst. Die Schnittlade-Technik wird verwendet, um das Ausmaß der gap-junctionalen Tracer-Kopplung zu quantifizieren, indem Raumkonstantenwerte berechnet werden, wie hier für drei experimentelle Bedingungen gezeigt. Die Schnittlade-Technik kann auch genutzt werden, um die elektrischen Synapsen zwischen anderen Zelltypen in der Netzhaut und bei anderen Arten zu untersuchen.

Beispielsweise veranschaulichen diese beiden Abbildungen, dass horizontale Zellen vom A-Typ und B-Typ bei Kaninchen unter dunkeladaptierten Bedingungen eine homologe Trägerkopplung nach Schnittbeladung und Diffusion von Neurobiotin aufweisen. Mithilfe der Schnittbeladungstechnik haben wir das Ausmaß der Trägerdiffusion über die Nexusstellen zwischen Stäbchen und Zapfen tagsüber und nachts untersucht. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um festzustellen, ob die Trägerkopplung zwischen anderen Netzhautneuronen durch die Netzhautuhr und/oder durch bestimmte Hell-Dunkel-Bedingungen reguliert wird.

Es kann auch verwendet werden, um die Tracer-Kopplung zwischen Neuronen in anderen Hirnregionen zu untersuchen.