Überwachung Equilibrium Veränderungen im RNA-Struktur von "peroxidativer" und "Oxidativer 'Hydroxylradikal Footprinting

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Faltung von RNA-Molekülen mithilfe eines Hydroxyl-Radikal-Footprints zu untersuchen. Dazu wird die RNA zunächst an einem Ende markiert, durch Gelelektrophorese gereinigt und vorgefaltet, um die konformationelle Integrität der RNA vor dem anschließenden, magnesiumvermittelten Faltungsprozess sicherzustellen. Danach werden Fenton-Reagenzien gemischt, um Hydroxylradikale zu erzeugen, die die RNA-Backbone entsprechend ihrer Lösungsmittelzugänglichkeit schneiden können. Anschließend werden die RNA-Spaltprodukte mittels denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.

Die Bandintegrale werden mithilfe einer halbautomatischen Footprinting-Analyse-Software quantifiziert. Das endgültige Ziel besteht darin, Faltungs-Isothermen zu erzeugen, die die Ausbildung der tertiären Struktur von RNA widerspiegeln. Dies wird erreicht, indem die normalisierten Bandintegrale auf die fraktionale Sättigung skaliert werden.

Die Isothermen können anschließend an die Hill-Gleichung angepasst werden. Der Hauptvorteil der Hydroxy-Footprinting-Methode besteht darin, dass man mithilfe kostengünstiger Chemikalien Informationen über die tertiäre Struktur von RNA erhält, da kleine Hydroxylradikale aufgrund ihrer hohen Aktivität ideale Sonden darstellen, um zwischen lösungsmittelzugänglichen und vergrabenen Nukleotiden zu unterscheiden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der RNA-Strukturbiologie zu beantworten.

Beispielsweise, wie nutzen Ribosomen Metallionen, um ihre aktive Konformation zu erreichen? Der Hydroxyl-Radikal-Footprint kann verwendet werden, um die Grundlagen der RNA-Spezifität und -Erkennung zu verstehen. Neben der Aufklärung von Informationen über die tertiäre RNA-Struktur kann diese Methode dazu dienen, die genauen Bindungsstellen von Proteinen an RNA- oder DNA-Molekülen zu bestimmen.

Die Hauptprobleme dieser Methode bestehen darin, eine Probenabbaustörung durch Ribonuklease zu verhindern und die Eisenzugabe zu optimieren, um die geeignete Menge an RNA-Spaltung zu erzielen. Außerdem kann die detaillierte Analyse der Bandabstände recht schwierig sein. Der wesentliche Vorteil dieses Videos liegt darin, dem Betrachter die Planungsphase und die erfolgreiche Durchführung eines Hydroxyl-Radikal-Footprint-Experiments verständlich zu machen. Vor Beginn dieses Protokolls bereiten Sie alle im schriftlichen Protokoll beschriebenen Footprint-Reagenzien vor.

Begleitend zu diesem Video kann RNA hergestellt werden, wobei DFOs vier verwandte und endmarkierte Moleküle enthalten, wie dort beschrieben. Reinigen Sie die radioaktiv markierte RNA mittels denaturierender Gelelektrophorese. Gewinnen Sie die gereinigte RNA durch zwei aufeinanderfolgende Gelextraktionen unter Verwendung von 0,3 molarer Natriumacetatlösung zurück.

Präzipitieren Sie dann die RNA, indem Sie 0,5 Milliliter der wässrigen Lösung mit einem Milliliter Ethanol mischen. Inkubieren Sie die Mischung für eine Minute auf Trockeneis. Nach dem Zentrifugieren des Probenmaterials entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das RNA-Pellet mit 70 %igem Ethanol.

Entfernen Sie das Überstand nach einer zusätzlichen Zentrifugation und trocknen Sie das Pellet im Vakuum. Lösen Sie anschließend die gereinigten mit P 32 markierten RNA-Proben. Pipettieren Sie 30 Mikroliter der RNA-Lösung in 330 Mikroliter einesmaligen Reaktionspuffer in ein neues Reaktionsröhrchen.

Fällen Sie die RNA mit Ethanol und trocknen Sie das Pellet anschließend im Vakuum. Sobald das Pellet getrocknet ist, kann es zur Erstellung der Referenzladder verwendet werden, wie in der schriftlichen Anleitung beschrieben. Denaturieren Sie die verbleibende gepufferte RNA-Lösung durch Erhitzen auf 95 Grad Celsius für zwei Minuten. Kühlen Sie die Proben 15 Minuten lang auf Raumtemperatur ab und zentrifugieren Sie sie kurz, um den Kondensat wieder in Lösung zu bringen. Um das Footprint-Experiment zu beginnen, richten Sie 27 Reaktionsgefäße ein, um genügend Proben für ein 30-Vertiefungen-Elektrophoresegel vorzubereiten.

Nachdem die Längenskalen und die gespaltene Kontrolle hinzugefügt wurden, die endgültigen Eisenmagnesium-Konzentrationen so bestimmen, dass sie über mehrere Größenordnungen hinweg um den Titrationsmittelpunkt gleichmäßig auf einer logarithmischen Skala verteilt sind. Die Herstellung der Magnesiumionen in einermal Reaktionspuffer wird im Text separat beschrieben. Die RNA- und die Magnesiumionen-Lösungen bei 50 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren. Anschließend 10 Mikroliter der RNA-Lösung mit 90 Mikrolitern der entsprechenden Menge an Eisenmagnesium-Lösung mischen.

Um ein Endvolumen von 100 Mikrolitern zu erreichen, jede Mischung 30 Minuten bei 50 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Lösungen eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius äquilibrieren lassen, während die RNA-Faltung stattfindet. In der Zwischenzeit, unmittelbar vor dem Start der Hydroxylradikalfußabdruckreaktion, die Phantomreaktionsmischung wie in dem schriftlichen Protokoll beschrieben vorbereiten.

Bereiten Sie die Peroxidationsreaktion vor, indem Sie jeweils zwei Mikroliter-Tropfen Eisen-EDTA-Natriumascorbat und Wasserstoffperoxid an der Innenseite des Reaktionsrohrs oberhalb der RNA-Lösung abpipettieren, sodass sich die Tropfen nicht berühren. Starten Sie die Footprinting-Reaktion durch kräftiges Mischen. Stoppen Sie die Reaktion nach 15 Sekunden durch Zugabe von 300 Mikroliter reinem kalten Ethanol.

Drehen Sie die Röhrchen drei bis fünfmal. Abschließend das Pellet ausfällen, waschen und trocknen, wie zuvor beschrieben. Als Alternative zur peroxidativen Reaktion würde die oxidative Hydroxylreaktion durch Zugabe von fünf Mikrolitern der frisch zubereiteten Fenton-Reaktionsmischung zu den Proben durchgeführt. Inkubieren Sie die oxidative Reaktion 30 Minuten bei 25 Grad Celsius.

Anschießend 300 µL reines kaltes Ethanol hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen, und durch Vorsichtiges Umkippen der Röhrchen mischen. Die Probe erneut ausfällen. Den Pellet nach Abschluss entweder der peroxidativen oder oxidativen Reaktion waschen und trocknen.

Lösen Sie die getrockneten RNA-Pellets in acht Mikrolitern Gel-Ladepuffer zwei auf. Überprüfen Sie mithilfe eines Geigerzählers, ob die mit P-32 markierte RNA resuspendiert ist, und bereiten Sie gemäß Standardprotokollen ein denaturierendes 8 %ige Polyacrylamid-Sequenziergel vor. Laden Sie die Proben, einschließlich zwei Referenzen und einer gespaltenen Kontrolle, unter Verwendung eines Kamms mit 30 Vertiefungen auf das Gel auf.

Trennen Sie die RNA-Fragmente zwei Stunden und eine halbe Stunde lang bei 60 bis 75 Watt. Belichten Sie das getrocknete Gel über Nacht auf einem Speicher-Phosphor-Screen. Scannen Sie den Phosphor-Screen mit einem Bildgebungssystem für die filmlose Autora diographie.

Übertragen Sie anschließend die Gel-Bilddatei auf den Computer zur Analyse. Öffnen Sie zur Durchführung der Datenanalyse Safa, eine Open-Source-Software zur Anpassung und Quantifizierung einzelner Banden. Laden Sie die RNA-Sequenz als TXT-Datei, gefolgt vom Gel-Bild als GEL-Datei.

Definieren Sie die Bahnen und passen Sie die Bandenintensitäten an. Wählen Sie dann eine Referenz-Bahn aus, und führen Sie eine Gelelektrophorese-Zuordnung der Banden zu den Nukleotiden anhand der RNA T1-Digestionsleiter durch. Quantifizieren Sie die Bandenintensitäten und verwenden Sie die Normalisierungs-/Farbdiagramm-Funktion, um die Daten zu normalisieren und potenziell invariante Reste zuzuweisen.

Speichern Sie die Ausgabe als TXT-Datei. SFA gibt eine Tabelle aus, die Spalten enthält, die für die Gelläufe stehen, und Zeilen, die den einzelnen Bandenintegralen entsprechen, die dem RNA-Fragment zuzuordnen sind. Zunächst müssen die Schutzstellen identifiziert werden, die eine erkennbare Änderung der Lösungsmittelzugänglichkeit aufweisen, indem man das Schutzprofil der Probe ohne Magnesiumionen mit dem Profil der Endkonzentration an Magnesiumionen vergleicht.

Je niedriger der Wert, desto stärker ist das Nukleotid vor Angriffen durch Hydroxylradikale geschützt, und umgekehrt. Erstellen Sie anschließend Übergangskurven der Bandenintensitäten einzelner oder Gruppen von Nukleotiden in Abhängigkeit von der Magnesiumeisenkonzentration, indem Sie jedes Übergangsverhalten im Tabellenformat individuell an die Funktion der fraktionalen Sättigung anpassen, wie im Textteil dieses Protokolls beschrieben. Als letzten Schritt passen Sie die Daten an die Hill-Gleichung an.

Diese Analyse skaliert den Übergang zur fraktionalen Sättigung, bestimmt den Übergangsmittelpunkt und liefert einen phänomenologischen Test dafür, ob ein Übergang sigmoidal verläuft. Hier sind repräsentative Ergebnisse aus P vier P sechs rRNA-Hydroxylradikal-Footprint-Experimenten. Isothermen wurden aus Sequenziergelen abgeleitet, die mit Safa analysiert und anschließend wie im Analyseabschnitt beschrieben angepasst wurden.

Das Gelelektrophoresebild zeigt, dass die Hintergrundspaltung minimal ist und eine Zuordnung auf einzelne Nukleotide möglich ist, da im T-Einzelband gut definierte Banden sichtbar sind. Die durch Hydroxylradikale hervorgerufene Fragmentierung der RNA liegt deutlich über dem Hintergrund. Der Übergang von niedrigen zu hohen Magnesiumionenkonzentrationen ist selektiv mit einer Abnahme der Intensität einzelner und Gruppen von Banden verbunden, was auf die Ausbildung von RNA hinweist.

Der Schutz der tertiären Struktur bezieht sich auf einzelne oder Gruppen benachbarter Nukleotide, deren Spaltung gleichzeitig erfolgt. Die Bandenintensitäten werden mittels Saffer-Analyse quantifiziert und normalisiert. Das Ergebnis ist eine Wärmekarte, die das Ausmaß des Schutzes gegenüber Hydroxylradikalen veranschaulicht. Der Farbverlauf beschreibt die Änderung der Zugänglichkeit nach Zugabe von Magnesiumionen: Weiß nach Rot zeigt zugänglichere Nukleotide an, während Weiß nach Blau stärker geschützte Nukleotide anzeigt.

Jedem Grauabstufungsgrad ist ein numerischer Wert zugeordnet, der als Schutzkurve dargestellt und mit einem Bindungsmodell wie der Hill-Gleichung analysiert werden kann. In diesem Beispiel ist die Gleichgewichtsdissociationskonstante, die mit dem Schutz von 1 5 3 bis 1 5 5 verbunden ist, ungefähr doppelt so hoch wie der entsprechende Wert für den Schutz von 1 6 3 bis 1 6 4. Dieses Hydroxy-Radikal-Footprint-Experiment kann bei sachgemäßer Durchführung in eineinhalb Tagen durchgeführt werden.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, Handschuhe und einen Laborkittel zu tragen, um jegliche RNA-Kontaminationen zu vermeiden. Außerdem hängt die endgültige Eisenkonzentration vom experimentellen System ab. Daher empfehlen wir, vor der Durchführung des Footprinting-Verfahrens gemäß dieser Anleitung ein Dosis-Wirkungs-Experiment durchzuführen.

Andere Methoden, wie beispielsweise die zeitaufgelöste Hydroxylradikalfußabdruck-Analyse, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten. Zum Beispiel: Zu welchem kritischen Zeitpunkt erreichen RNA-Moleküle nach ihrer Entstehung eine fehlgefaltete oder aktive Konformation? Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Strukturbiologie, inter- sowie interimäre molekulare tertiäre Wechselwirkungen von Nukleinsäuren zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Ausbildung der tertiären Struktur von RNA-Molekülen bestimmt werden kann. Vergessen Sie nicht, dass caate und Phosphor Stufe zwei gefährlich sind; Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schutzbrille sowie die Verwendung einer Plexiglasschutzvorrichtung werden empfohlen, während dieses Verfahren durchgeführt wird.