Ein-Tages-Workflow-Schema für bakterielles Pathogen-Erkennung und Resistenz gegen antimikrobielle Tests aus Blutkulturen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Antibiotikasuszeptibilität von Blutkulturisolaten schneller zu identifizieren und zu bewerten als mit herkömmlichen Methoden. Dies wird erreicht, indem zunächst das Isolat aus der Blutkultur identifiziert wird, und zwar mithilfe eines neuartigen 16S-ribosomalen DNA-MultiPro-PCR-Assays.

Anschließend wird der Isolat sechs Stunden lang mit einer Reihe von Antibiotika inkubiert. Der nächste Schritt besteht darin, das Wachstum oder die Wachstumshemmung des Isolats in Gegenwart des Antibiotikums mithilfe eines quantitativen 16S-ribosomalen DNA-PCR-Assays zu bestimmen. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass Identifizierung und Antibiotikaempfindlichkeitstestung eines Blutkulturisolats durch diese Kombination aus Kultur und PCR schneller erzielt werden können.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie jenen mit automatisierten Phoenix- oder IIC-Systemen besteht darin, dass kein vorheriger Kultivierungsstatus erforderlich ist und Ergebnisse der Identifizierung sowie der Antibiotikaresistenzbestimmung noch am selben Tag verfügbar sein können. Die Durchführung des Verfahrens wird Vandy Hanson und GID ing PhD-Studenten aus unserem Labor demonstrieren. Verdünnen Sie 100 Mikroliter Blutkultur, die positiv auf mikrobielles Wachstum getestet wurde, in einem Reaktionsröhrchen, das 900 Mikroliter 0,9-%-Natriumchlorid enthält. Zentrifugieren Sie danach die Probe bei 13.400 × g für fünf Minuten, um die Bakterien zu pelletieren, nach der Zentrifugation.

Reese, resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern steriler demineralisierter Wasser. Bewahren Sie die Probe bei vier Grad Celsius bis zur weiteren Verwendung auf. Sobald alle Proben vorbereitet sind, bereiten Sie die Echtzeit-PCR-Reaktionsmischungen vor, um spezifische 16S-ribosomale DNA der interessierenden Bakterien zu amplifizieren.

Verwenden Sie demineralisiertes Wasser, um die Volumina auf 20 Mikroliter pro Reaktion einzustellen. Portionieren Sie 20 Mikroliter PCR-Mix pro Vertiefung in eine 96-Loch-PCR-Platte. Geben Sie anschließend fünf Mikroliter Probe in jede Vertiefung und verschließen Sie die PCR-Platte.

Führen Sie als Nächstes die PCR auf dem ABI Prism 7900HT Echtzeit-PCR-System durch. Um die Ergebnisse nach Abschluss der PCR zu analysieren, passen Sie zunächst im Register „Analyse-Einstellungen“ die CT-Analyse auf 0,1 an. Anschließend begrenzen Sie die Baseline-Konfiguration auf Zyklus sechs bis Zyklus 15. Notieren Sie den CT-Wert für jede Probe.

Der Schwellenwert, ab dem ein PCR-Ergebnis als positiv betrachtet wird, kann im Allgemeinen auf einen CT-Wert von 35 festgelegt werden. In diesem Beispiel wird das Identifikationsprofil einer mit E. coli infizierten Blutkultur in zwei Reaktionsgemischen gezeigt. Universelle 16S-ribosomale DNA-Primer wurden hinzugefügt und erzeugten zwei Amplifikationskurven mit CT-Werten von 25,2 und 25,95.

Die dritte Amplifikationskurve ergibt sich aus der für Coli spezifischen Sonde. Andere spezifische Sonden erzeugten keine nachweisbaren Signale. Sobald der Erreger identifiziert wurde, kann eine Antibiotikatestung durchgeführt werden.

Übertragen Sie zunächst fünf Milliliter Brühe aus einer positiven Blutkultur in ein Serumtrennrohr. Zentrifugieren Sie die Probe bei 2000 ×g für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation entsorgen Sie das Überstandsmittel aus dem Röhrchen. Übertragen Sie dann mithilfe eines sterilen Wattestäbchens die Bakterien aus der Gel-Schicht des Röhrchens in 0,9 % Natriumchlorid, bis eine Lösung mit der Trübung eines 0,5-McFarland-Standards erreicht ist.

Dies entspricht etwa 1,5 × 10⁸ koloniebildenden Einheiten pro Milliliter. Verdünnen Sie die Suspension anschließend in doppelt konzentrierter Mueller-Hinton-Brühe, um eine Konzentration von ungefähr 5 × 10⁵ koloniebildenden Einheiten pro Milliliter zu erhalten.

Geben Sie 50 µL der Suspension pro Vertiefung in eine Mikrotiterplatte, die bereits 50 µL pro Vertiefung einer Auswahl an Antibiotika enthält. Stellen Sie sicher, dass positive Wachstumskontrollen für jede Probe durch Vertiefungen mit Wasser anstelle von Antibiotika eingeschlossen werden. Decken Sie die Platte nach Abschluss ab.

Anschließend die Platte sechs Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren, um das bakterielle Wachstum zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass eine Aliquotte der Bakteriensuspension als Negativkontrolle für das Wachstum bei vier Grad Celsius aufbewahrt wird. Nach der sechsstündigen Inkubation den Inhalt jedes Wells sowie die Probe der Negativkontrolle in separate sterile Röhrchen überführen.

Nach einer fünfminütigen Zentrifugation bei 16.000 × g werden 80 µL Überstand entfernt und die Pellets in 80 µL steriler, demineralisierter Wasser resuspendiert. Die Proben vor der Verwendung für die 16S-ribosomale DNA-Echtzeit-PCR im Verhältnis 1:10 in Wasser verdünnen.

Den PCR-Ansatz mit dem IQ-Cyber-Green-Supermix und 16S-ribosomalen DNA-Primern vorbereiten und je 20 Mikroliter pro Vertiefung in eine 96-Loch-PCR-Platte aliquotieren. Anschließend je fünf Mikroliter jeder Probe zu den Vertiefungen hinzufügen und die Platte versiegeln.

Führen Sie als Nächstes die PCR zur Analyse der Ergebnisse durch. Berechnen Sie zunächst den Grenzwert für den CT-Wert. Im Allgemeinen entspricht der Grenzwert-CT dem CT-Wert der positiven Wachstumskontrolle plus 0,5-mal dem CT-Wert der negativen Wachstumskontrolle minus dem CT-Wert der Wachstumskontrolle.

Doch bei Piperacillin mit Tazobactam und CEF Dazadi bei gramnegativen Stäbchen sowie bei Amoxicillin, Oxacillin und Trimethoprim mit Sulfamethoxazol bei Staphylococcus aureus oder ab Amoxicillin bei Enterococcus SPP sollte der Verdünnungsfaktor von 0,5 auf 0,25 verringert werden. Die Empfindlichkeit oder Resistenz der Stämme in jeder Probe kann durch Vergleich der CT der Probe mit der Cutoff-CT bestimmt werden.

Ein CT-Wert oberhalb der Grenze weist auf Empfindlichkeit hin, während ein CT-Wert unterhalb der Grenze auf Resistenz hindeutet. Hier sehen Sie ein Beispiel eines Verstärkungsdiagramms zur Antibiotikasuszeptibilität. Der zuvor identifizierte E. coli-Stamm wurde auf Empfindlichkeit gegenüber mehreren Antibiotika getestet, die jeweils durch eine separate Kurve dargestellt werden.

Proben mit einem niedrigen CT-Wert sind Proben, in denen ein Wachstum in Gegenwart eines Antibiotikums aufgetreten ist, was auf eine Resistenz gegenüber dem getesteten Antibiotikum hinweist. Umgekehrt repräsentiert ein hoher CT-Wert eine Probe, in der kein Wachstum stattgefunden hat, was auf eine Empfindlichkeit gegenüber dem getesteten Antibiotikum schließen lässt. Ist die Methode einmal beherrscht, kann sie innerhalb von neun Stunden durchgeführt werden, sofern sie korrekt angewendet wird.