High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Influenzavirus-Titer in den Atemwegen infizierter Mäuse effizient zu quantifizieren. Mäuse werden zunächst zu einem ausgewählten Zeitpunkt nach der Infektion intranasal mit Influenzavirus infiziert.

Die M werden geopfert und die bronchoalveoläre Lavage oder BAL-Flüssigkeit wird gesammelt. Anschließend wird die BAL-Flüssigkeit verwendet, um MDCK-Zellen zu infizieren. Infizierte Zellen können dann mit spezifischen primären Antikörpern auf das Vorhandensein viraler Proteine gefärbt werden, gefolgt von infrarotmarkierten sekundären Antikörpern.

Infrarotsignale werden mit dem Lycor-Odyssey-Scanner ausgelesen, und mit der Odyssey-Software können virale Titer bestimmt werden. Mithilfe einer Standardkurve lässt sich eine quantitative Bestimmung der viralen Titer erzielen. Die wichtigsten Vorteile dieser Methode im Vergleich zu bestehenden Verfahren sind die präzise Quantifizierung der viralen Titer, die Reproduzierbarkeit und das geringe Probenvolumen, das für den Assay benötigt wird.

Die Implikationen dieser Technik können auf die Diagnose und Therapie verschiedener respiratorischer Viruskrankheiten ausgedehnt werden, da sie zur Quantifizierung viraler Titer in klinischen Proben nach diesem Verfahren verwendet werden kann. Andere Methoden wie die qPCR können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen, beispielsweise zur Virus-Kopienzahl, zu beantworten. Bei der Anwendung dieser Technik ist es wichtig, daran zu denken, den Titer des Standardkontrollvirus nach dieser Entwicklung zu überprüfen.

Diese Technik ebnet den Weg für Forscher im Bereich der viralen Logik, um Virus-Titer oder verdrehte Virusproteine in klinischen Proben zu untersuchen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von 17 Stunden durchgeführt werden. Mäuse werden präzise intranasal mit 5.000 infektiösen Einheiten oder PFU des PR8-Influenzavirus in 30 Mikroliter steriler PBS oder allein mit PBS als negativer Kontrolle infiziert, um BAL-Flüssigkeit von euthanasierten Tieren zu gewinnen. Zunächst wird die Brusthöhle geöffnet und mit feinen sterilen Scheren ein etwa ein Zentimeter langer Schnitt parallel zur Luftröhre gesetzt, um diese freizulegen.

Erstellen Sie einen kleinen Einschnitt in die Trachea, spülen Sie die Trachea mit 0,5 Milliliter PBS, das 1 % BSA enthält, aus und aspirieren Sie die Lavageflüssigkeit vorsichtig wieder ab. Lagern Sie die BAL-Flüssigkeiten bei minus 20 Grad Celsius, um die Virus-Titer in den Lavageflüssigkeiten zu quantifizieren. Kultivieren Sie zunächst 5 Millionen MDCK-Zellen in 20 Milliliter vollständigem RPMI über Nacht bei 37 Grad Celsius; am nächsten Tag werden die Zellen geerntet und in eine optisch flache, schwarze 96-Well-Platte mit durchsichtigem Boden mit je 10.000 Zellen pro Mulde ausplattiert.

Anschließend die Platte nach der Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Den Überstand vorsichtig abpipettieren und die Zellen zweimal mit komplettem, aber serumfreiem DMEM gewaschen, das anstelle von FBS 0,2 % BSA enthält. Nach dem Waschen der Zellen 50 Mikroliter BAL-Flüssigkeit oder 50 Mikroliter einer Suspension mit einer bekannten Konzentration des Virus pro Mulde hinzufügen.

Anschießend 50 µL DMEM-Medium pro Mulde zugeben, das TPCK-behandeltes Trypsin mit einer Konzentration von 0,2 µg/mL enthält, um die virale Anheftung, den Eintritt und die Replikation zu verbessern. Die Zellen eine Stunde bei 37 °C inkubieren, damit das Virus adsorbieren kann. Danach 100 µL komplettes RPMI-Medium mit FBS pro Zellkultur in jeder Mulde zugeben und die Zellen über Nacht kultivieren, um die Ausbreitung der Infektion nach der Übernacht-Inkubation zu ermöglichen.

Waschen Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern 1 % BSA-PBS. Nach dem Waschen geben Sie 100 Mikroliter pro Mulde 1 % Paraformaldehyd zu und inkubieren die Platten fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu fixieren. Anschließend waschen Sie mit 100 Mikrolitern pro Mulde 1 % BSA-PBS und inkubieren die Zellen weitere 30 Minuten zur Blockade. Nach der Blockade geben Sie 50 Mikroliter pro Mulde primären antiviralen M2-Antikörper im Verdünnungsverhältnis 1:1000 zu und inkubieren die Platten eine Stunde bei Raumtemperatur, um eventuell vorhandene virale Proteine anzufärben. Danach waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 % BSA-PBS und inkubieren sie mit 100 Mikrolitern pro Mulde sekundärem, mit Infrarotfarbstoff konjugiertem Antikörper im Verdünnungsverhältnis 1:200 eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Färbung waschen Sie die Zellen dreimal wie zuvor beschrieben.

Danach die Platten auf der Leseglasplattform des Licor Odyssey-Infrarot-Scanners positionieren. Im Licor Odyssey-Software die 96-Loch-Platten-Einstellung am Lesegerät auswählen. Die leeren negativen Kontrolllöcher identifizieren und anschließend die Fluoreszenz der gesamten Platte quantifizieren.

Verwenden Sie das Auto-Form-Werkzeug, um den interessierenden Bereich oder ROI in der Mitte eines Tests zu zeichnen. Wir verwenden den ROI aus einer negativen Kontrolle, um den Basis-Fluoreszenzwert für den Assay festzulegen, und führen dann die beiden entgegengesetzt angeordneten Fadenkreuze, die von der Odyssey-Software innerhalb des ROI bereitgestellt werden, ein, um die Intensität der Fluoreszenz über den gesamten Probenträger zu messen.

Als Nächstes scannen Sie die Platte unter Verwendung des 780 Nanometer-Kanals zur Detektion und des 680 Nanometer-Kanals als Referenzwellenlänge. Sobald der Lesebefehl aktiviert wurde, werden die Fluoreszenzintensitäten in gleichmäßigen Abständen der ROI gemessen. Anschließend werden die erfassten Datenpunkte integriert.

Ein Multiplikator der Standardabweichung legt das Ausmaß des Signals über der Grundlinie fest, das in die ROI einbezogen wird. Achten Sie darauf, die Option „integrierte Intensität“ für die Berechnungen auszuwählen, da diese das netto Pixelvolumen für definierte Bereiche unabhängig von deren Größe angibt. Die Hintergrundfluoreszenz wird aus den Mock-infizierten Kontrollen quantifiziert und zur Schätzung der integrierten Intensität in den Testproben verwendet. Die Infrarotfluoreszenz aus duplizierten Proben, die serielle Verdünnungen titrierter Viren enthalten, wird zur Erstellung einer Standardkurve verwendet.

Anschließend kann die Standardkurve verwendet werden, um die Titer der Bronchoalveolären Lavageflüssigkeit von infizierten Mäusen zu bestimmen. In diesem Experiment wurde ein signifikanter Anstieg der Viruslast am zweiten und vierten Tag beobachtet. Nach der Infektion war das Virus bis zum zehnten Tag, wie hier gezeigt, eliminiert.

Mittels dieses Assays gemessene virale Titer korrelieren gut mit dem Gewichtsverlust von Mäusen nach einer Infektion. Diese Technik kann auch auf humane Proben angewendet werden. Dargestellt ist hier eine Quantifizierung des H1N1-Virus aus einem menschlichen Nasenabstrich.

Die Nachweisgrenze liegt hier bei 10 hoch 3 TCID, der infektiösen Dosis für Gewebekulturen. Nach dem Anschauen dieses Videos haben Sie zudem ein gutes Verständnis dafür, wie man die Titer von Influenzaviren mithilfe eines auf Infrarotfarbstoffen basierenden Assays abschätzen kann. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist entscheidend, da die Verwendung des Corp-Imagers schwierig sein kann; dies wird dazu beitragen, unsere Methoden zur Quantifizierung viraler Titer in einer 96- oder 384-Loch-Platte zu vereinfachen und zu veranschaulichen.

Und schließlich: Arbeiten mit Viren können äußerst gefährlich sein, und Vorsichtsmaßnahmen wie beispielsweise persönliche Schutzausrüstung sollten stets getroffen werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.