Ein einfaches Protokoll für Thrombozyten-vermittelte Verklumpung
16. Mai 2013
Diese Methode untersucht die Blutplättchen-vermittelten Verklumpung Phänotyp Plasmodium falciparum-Infizierten Erythrozyten (pRBC) in klinischen Isolaten. Dies wird durch Isolieren und Co-Inkubation von Plättchen-reichem Plasma und eine Suspension von pRBC durchgeführt.
Dieses Verfahren bietet standardisierte Richtlinien zur Durchführung von Thrombozyten-vermittelten Agglutinationsassays klinischer oder laborbasierter Plasmodium falciparum-Isolate. Zunächst wird Blut von einem infizierten Patienten entnommen und die parasitierten Erythrozyten durch Zentrifugation gewonnen, anschließend werden die asexuellen reifen Stadien kultiviert und gereinigt. Danach wird Blut von einem gesunden Spender entnommen, um das thrombozytenreiche Plasma durch Zentrifugation herzustellen und zu standardisieren.
Vereinigen Sie sowohl die Thrombozyten als auch die parasitierten Erythrozyten für den Agglutinationstest. Ergebnisse aus der Immunfluoreszenzmikroskopie können P. falciparum-Agglutinate zeigen, die durch Thrombozyten vermittelt werden. Diese Technik ist speziell dafür konzipiert, das Agglutinationsphänotyp von Plasmodium falciparum zu messen.
Klinische Isolate unter ressourcenarmen Bedingungen. Es wurde berichtet, dass minimale Variationen in den Verfahren den Einfluss auf das Ergebnis der Agglutinationsreaktion im Feld erhöhen können. Daher war ein klares und leicht verständliches Protokoll, das an ressourcenarme Umgebungen angepasst ist und zur Standardisierung an malariagefährdeten Feldstandorten dient, erforderlich. Sammeln Sie in einem Vacutainer mit Natriumcitrat etwa fünf Milliliter Vollblut von einem malaria-naiven Wirt oder 2,5 Milliliter Blut von Patienten mit zerebraler Malaria (CM) oder schwerer Malaria (SM).
Zentrifugieren Sie das Vollblut bei 250 Gs für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Überführen Sie anschließend vorsichtig das trübe Überstandsgemisch in ein sauberes 15-Milliliter-Gefäß. Beachten Sie, dass Thrombozyten leicht durch Temperaturschwankungen und mechanische Erschütterungen aktiviert werden können.
Zählen Sie die PRP-Suspension mithilfe einer Neubauer-Zählkammer und eines Hämozytometers und stellen Sie die gewünschte Konzentration mit PBS ein, um ein plättchenarmes Plasma-Pellet zu erhalten, indem der Großteil der Plättchen aus einem Teil des PRP-Fraktionen durch Zentrifugation bei 1500 ×g für 10 Minuten abgetrennt wird. Lagern Sie die PRP- und PPP-Fraktionen bei vier Grad Celsius bis zu acht bis 10 Tage lang. Verwenden Sie idealerweise frische Plättchen für den Agglutinationsassay.
Waschen Sie die pelletierten peripheren roten Blutkörperchen dreimal mit fünf bis 10 Milliliter RPMI 1640 in einem Kulturkolben. Ergänzen Sie die pelletierten roten Blutkörperchen mit standardmäßigem Malaria-Kulturmedium und frischen, nicht infizierten roten Blutkörperchen, um einen Hämatokrit von 5 % zu erreichen. Durchströmen Sie die Kulturkolben mit einer Mischung aus 92,5 % Stickstoff, 2,5 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Verschließen Sie anschließend die Kolben und kultivieren Sie die reifen Parasiten aus peripheren Blutkörperchen des Patienten.
Inkubieren Sie die Kulturschale 24 bis 36 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Geben Sie etwa 10 bis 15 Mikroliter Blut auf ein Ende eines beschlagenen Objektträgers, der auf einer flachen Oberfläche liegt. Berühren Sie den Blutstropfen mit der Kante eines zweiten Objektträgers, bis sich das Blut gleichmäßig über die Kante des zweiten Objektträgers verteilt, während Sie diesen unter einem Winkel von 45 Grad halten.
Schnell, aber vorsichtig und ohne zu starken Druck auf dem ersten Objektträger auszuüben, das Blut gleichmäßig auf dem ersten Objektträger verteilen. Anschließend den dünnen Blutfilm an der Luft trocknen lassen, den Probeneinsatzbereich 10 Sekunden lang mit Methanol dehydrieren. Danach erneut an der Luft trocknen und die Probe anschließend mit 2% Keem benetzen.
Mindestens 10 Minuten andauern lassen. Gründlich spülen, bis das Wasser klar abläuft, und an der Luft trocknen. Die Proben unter einem 100x-Öl-Immersionsoptikobjektiv am Lichtmikroskop untersuchen.
Als Nächstes reinigen und synchronisieren Sie die reifen PFS parum, PRBC, wie im Textprotokoll beschrieben. Überführen Sie die gesamte Kultur in ein sauberes, steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei Raumtemperatur bei 370 ×g für fünf Minuten.
Aspirieren Sie nun vorsichtig den Überstand, ohne den Pellet zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen dann derart, dass eine Hälfte des Gesamtvolumens jello fusing ist. Ein Drittel der zweiten Hälfte ist proteinfreies Medium und zwei Drittel der zweiten Hälfte sind pbcs.
Überführen Sie die Suspension in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie sie 15 bis 20 Minuten lang in einem 37 °C warmen Inkubator, bis sich eine deutliche Abgrenzung zwischen oberer und unterer Phase bildet. Überführen Sie vorsichtig die obere Schicht in ein frisches steriles 15-Milliliter-Röhrchen und geben Sie 10 Milliliter frisches RPMI hinzu. Zentrifugieren Sie bei 370 bis 430 ×g für fünf Minuten. Entsorgen Sie anschließend vorsichtig den Überstand.
Beurteilen Sie nun Parasit und Entwicklungsstadium durch Dünngestreif aus Blut und untersuchen Sie unter dem Lichtmikroskop, wie zuvor beschrieben. Stellen Sie die nach der Plasmagelflotation erhaltene P-RBC-Suspension auf eine Konzentration von einem Mal 10 hoch acht P-RBCs pro Mikroliter in einem frischen 1,5-Milliliter-Röhrchen ein. Wir suspendieren PBZ mit 5 % Hämatokrit in Aine Orange oder Athérium-Bromid bei einer Endkonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter sowie PRP bei 10 % des Gesamtvolumens.
Bereiten Sie in ähnlicher Weise die folgenden Kontrollen vor: uninfizierte rote Blutkörperchen sowie PRP und PRBC mit PPP, um die Rolle der Thrombozyten bei der Agglutination der PBC zu überprüfen. Überführen Sie nun die Suspension in ein 2-mL-Schraubverschlussfläschchen. Stellen Sie das Fläschchen unter leichter Agitation durch Rollen bei 10 bis 12 U/min bei Raumtemperatur und entnehmen Sie in Intervallen von 15 bis 20 Minuten Proben über insgesamt 120 Minuten, um die Bildung von Agglutinaten zu überprüfen.
Pipettieren Sie 10 Mikroliter der Probe auf einen Objektträger und bedecken Sie sie mit einem Deckglas, um sie unter Fluoreszenz zu untersuchen. Ein Zellhaufen gilt als ein Aggregat aus drei oder mehr infizierten Erythrozyten. Dieses Experiment analysierte etwa 70 % reife Stadien von p FALs parem nach Anreicherung durch Plasmagelschwimmen. Die Klumpen sind unter dem Mikroskop leicht zu erkennen, sowohl im normalen Licht als auch im Fluoreszenzlicht. Im normalen Licht erscheinen sie als Zellaggregate, im Fluoreszenzlicht als grüne oder rote Flecken.
Wenn sie jeweils mit Acro und Orange oder Atheriumbromid angefärbt werden. Die Klumpengröße nimmt signifikant zu, wobei der Durchschnitt nach einer Inkubation von 120 Minuten über 15 PBZ pro Klumpen liegt, wobei einige Klumpen zahlreiche PBZ pro Klumpen enthalten, die visuell nicht gezählt werden konnten. Die Häufigkeit des Verklumpungsphänotyps wird als Anzahl infizierter Zellen in Klumpen pro 1000 infizierte Zellen berechnet, die in duplizierten Assays gezählt wurden.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein klares Verständnis dafür haben, wie man einen Plasmodium falciparum-vermittelten Thrombozytenaggregationsassay durchführt. Achten Sie darauf, die Thrombozyten nicht durch ruckartige Bewegungen und Temperaturschwankungen zu aktivieren. Dieser Assay kann auch zur Messung der thrombozytenvermittelten Aggregation bei schwerer Malaria angewendet werden.
Übersicht
Diese Methode untersucht das plättchenvermittelte Agglutinationsphänomen von Plasmodium falciparum-infizierten Erythrozyten in klinischen Isolaten. Das Verfahren beinhaltet die Isolierung und gleichzeitige Inkubation von plättchenreichem Plasma mit einer Suspension parasitierter roter Blutkörperchen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Mikrobiologie
- Klinische Forschung
Hintergrund
- Die thrombozytenvermittelte Agglutination ist ein bedeutendes Phänomen in der Malaria-Pathologie.
- Das Verständnis dieser Agglutination kann zur Beurteilung der Malaria-Schwere beitragen.
- Standardisierte Methoden sind für die Reproduzierbarkeit in der Forschung unerlässlich.
- Diese Studie konzentriert sich auf klinische Isolate in ressourcenarmen Umgebungen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines standardisierten Protokolls für thrombozytenvermittelte Agglutinationsassays.
- Bestimmung des Agglutinationsphänotyps von Plasmodium falciparum.
- Unterstützung der Forschung in malariaendemischen Regionen.
Verwendete Methoden
- Blutentnahme von infizierten Patienten und gesunden Spendern.
- Zentrifugation zur Isolierung von parasitierten Erythrozyten und Herstellung plättchenreiches Plasma.
- Gemeinsame Inkubation von Thrombozyten mit parasitierten roten Blutkörperchen.
- Beurteilung der Agglutination mittels Immunfluoreszenzmikroskopie.
Hauptergebnisse
- Das Agglutinationsphänomen wurde erfolgreich in klinischen Isolaten gemessen.
- Plättchenaktivierungsbedingungen wurden identifiziert, um die Variabilität zu minimieren.
- Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Bildung von Agglutinaten nach der Inkubation.
- Die Größe der Agglutinate nahm im Verlauf der Zeit signifikant zu, was auf eine aktive Agglutination hindeutet.
Schlussfolgerungen
- Der Test bietet eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Malaria-Pathologie.
- Die Standardisierung ist entscheidend für konsistente Ergebnisse in unterschiedlichen Umgebungen.
- Diese Methode kann für die Anwendung in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die von Thrombozyten vermittelte Agglutination von Plasmodium falciparum-infizierten Erythrozyten stellt ein messbares Phänotyp dar, das mit der Schwere der Malaria in endemischen Populationen verknüpft ist. Die Standardisierung dieses Assays ermöglicht eine konsistente Bewertung der Parasitenadhäsionsmechanismen an verschiedenen, ressourcenbegrenzten Feldstandorten. Dies unterstützt die Validierung von Wirkstoffzielen und die mechanistische Risikominderung bei der Entwicklung antimalarischer Therapeutika, indem in-vitro-Phänotypen mit klinischen Ergebnissen verknüpft werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Wirt-Parasit-Adhäsionswegen, an denen die Rezeptoren CD36 und gC1qR/HABP1/p32 beteiligt sind.
- Operativer Wert: Bietet ein standardisiertes Verfahren zur Beurteilung des Klumpungsphänotyps in klinischen Isolaten ohne Kryokonservierung.
- Prädiktiver Wert: Verbindet die in vitro-Klumpungshäufigkeit mit der Krankheitsschwere in Patientengruppen und unterstützt damit Studien zur Biomarker-Assoziation.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Verwendet thrombozytenreiches Plasma und gereinigte parasitierte Erythrozyten, um quantitative Agglutinationsmessungen zu erzeugen.
- Reproduzierbarkeit: Legt Zentrifugations-, Inkubations- und Probenahmeintervalle fest, um die Variabilität unter Bedingungen mit begrenzten Ressourcen zu minimieren.
- Skalierbarkeit: Benötigt minimale Ausrüstung (Zentrifuge, Mikroskop), wodurch ein Einsatz an verschiedenen malariaendemischen Feldstandorten ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Verbindet die von Thrombozyten vermittelte Agglutination mit schweren Malaria-Phänotypen, die bei pädiatrischen Fällen von zerebraler Malaria beobachtet werden.
- Übertragbare Kontinuität: Ermöglicht den Übergang von der Untersuchung von Feldisolaten zu mechanistischen Studien zur Hemmung von Adhäsionsrezeptoren.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die Priorisierung von Verbindungen oder Antikörpern, die die von Thrombozyten vermittelte Agglutination in präklinischen Modellen unterbrechen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in die Malaria-Forschungskontinuum von der frühen Target-Validierung bis zur präklinischen Bewertung von Adhäsions-blockierenden Interventionen ein.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Parasiten-Ligand-Rezeptor-Interaktionen, die an der Sequestrierung und mikrovaskulären Pathologie beteiligt sind.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Ergebnisse (Häufigkeit und Größe von Zellverbänden) zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die thrombozytenvermittelte Aggregation.
- Analytik: Erzeugt messbare Endpunkte – Anzahl der Zellverbände pro 1000 infizierte Zellen und durchschnittliche Größe der Zellverbände –, die Vergleiche zwischen verschiedenen Isolaten und Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die in-vitro-Phänotypisierung mit klinischen Korrelationen aus ex-vivo-Daten schwerer Malaria-Patientenkohorten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Beurteilung von Adhäsionsphänotypen über verschiedene Plasmodium-falciparum-Stämme und geografische Isolate hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Unklarheit bei der Parasiten-Sequestrierung, indem ein Rezeptor-vermittelter Adhäsionsphänotyp quantifiziert wird.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung durch definierte Thrombozytenpräparation, Anreicherung der Parasiten und zeitlich festgelegte Inkubationsschritte sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert die Go/No-Go-Entscheidungen in antimalariellen Programmen, indem Verbindungen identifiziert werden, die pathogene Adhäsionsmechanismen hemmen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem die Hemmung der in-vitro-Verklumpung mit einer möglichen Verringerung schwerer Malaria-Verläufe verknüpft wird.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Parasitologie, Umgang mit Blutproben und Mikroskopie zur genauen Herstellung von Isolaten und Erkennung von Zellagglomerationen.
- Setzt Zugang zu einer Zentrifuge voraus, um plättchenreiches Plasma herzustellen und infizierte Erythrozyten zu reinigen.
- Erfordert eine Standardisierung der Schüttelgeschwindigkeit (10–12 U/min) und der Probenahmeintervalle (15–20 min) zwischen verschiedenen Standorten, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Muss die Empfindlichkeit der Thrombozyten gegenüber Temperaturschwankungen und mechanischer Belastung während der Isolierung und Versuchsdurchführung berücksichtigen.
- Auf qualitative und semiquantitative Auswertungen beschränkt, sofern nicht mit automatisierter Bildgebung oder Durchflusszytometrie kombiniert, um eine Hochdurchsatz-Anpassung zu ermöglichen.
