Parallel-Platten-Flow-Kammer und Continuous Flow Circuit endothelialen Vorläuferzellen unter Laminar Flow Schubspannung Bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Video-Artikels besteht darin, eine Technik zu beschreiben, mit der adhärente Zellen laminarer Strömung ausgesetzt und ihre Reaktion auf gut quantifizierbare Fluidschubspannungen bewertet werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst der Strömungskreislauf ohne die Strömungskammer aufgebaut wird. Der Kreislauf umfasst das Reservoirpuls, einen Pulsdämpfer, Hartrohre, Weichschläuche, Vierwegehähne und verbundene Luer-Adapter sowie einen Luftfilter.

Der nächste Schritt besteht darin, den Kreislauf unter sterilen Bedingungen mit dem gewünschten durchfließenden Medium, beispielsweise Zellkulturmedium, zu füllen und anschließend die Pumpe einzuschalten, um den Pulsdämpfer zu füllen und die Schläuche von Luft zu befreien. Danach wird die mit Zellen bestückte Objektträgerkammer in die untere Platte der Durchflusskammer eingesetzt. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die vollständige Montage des Durchflusskreislaufs, wobei die Durchflusskammer in Reihe geschaltet wird.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Ausrichtung von fluoreszenzmarkierten endothelialen Vorläuferzellen unter Einwirkung von Scherkräften durch die transparente Kammer mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops zeigen. Um das funktionelle Verhalten von Zellen zu untersuchen, ist es oft notwendig, die in vivo-Physiologie nachzuahmen, indem die Zellen Scherkräften ausgesetzt werden. Wir haben eine Parallelplatten-Flusskammer und einen geschlossenen Durchflusskreislauf entwickelt, die es uns ermöglichen, die Zellen unter Strömungsbedingungen zu untersuchen und durch die transparente Kammer hindurch zu beobachten.

Diese Technik kann als wertvolles Forschungsinstrument für die Bereiche Medizin und Ingenieurwesen dienen. Unsere Durchflusskammer ermöglicht die intermittierende oder Echtzeit-Visualisierung von Zellen unter Durchflussbedingungen, und zwar mit einem aufrechten oder invertierten Mikroskop. Darüber hinaus erlaubt die Konstruktion von Dr. Ach Nick den Forschern, Zellen auf transparenten oder röntgendichten Oberflächen mithilfe herkömmlicher Mikroskopobjektive abzubilden.

Außerdem kann es als wichtiges Werkzeug in der pharmakologischen Forschung genutzt werden, um die Wirkung von Arzneimitteln auf Zellen unter Flussbedingungen zu untersuchen. Die Visualisierung des Versuchsaufbaus ist entscheidend, da mehrere Schritte allein durch das Lesen eines Protokolls nur schwer zu beherrschen sind. Ich werde Schritt für Schritt Anweisungen zur Einrichtung der Flusskammer und des Flusssystems geben, das üblicherweise im Labor von Dr. Ock Next verwendet wird, um das Flusssystem zusammenzubauen.

Befestigen Sie zunächst ein 36 Zoll langes Stück Hartrohr an einem Ende eines Pulsdämpfers und am anderen Ende ein 18 Zoll langes Stück Weichrohr. Bringen Sie am Ende des 18 Zoll langen Weichrohrabschnitts einen 1/8 Zoll großen männlichen Luer-Adapter an.

Verbinden Sie den männlichen Lockstoff mit einem 1/8-Zoll-Weibchen-Adapter. Befestigen Sie das Weibchen an einem neuen 45-cm-Abschnitt weichen Schlauchs. Bohren Sie drei Löcher in einen 250-mL-Glaskolbenverschluss.

Um die Schläuche anzubringen, stecken Sie ein 1,5 Zoll langes Stück weichen Schlauchs in ein Loch ein, das als Luftentlüftung dient. Führen Sie die freien Enden des harten und des weichen Schlauchs durch die anderen beiden Löcher in den Deckel in die 250-Milliliter-Glasflasche, die als Vorratsbehälter fungiert.

Stellen Sie sicher, dass das starre Schlauchstück bis zum Boden des Reservoirs reicht. Die Aufrechterhaltung der Sterilität während der gesamten Montage des Kreislaufs ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens. Daher müssen alle Teile sterilisiert werden, und Sie müssen während des gesamten Vorgangs sterile Handschuhe tragen.

Zusätzlich zu den zusammengesetzten Teilen müssen diese Teile sterilisiert werden. Eine komplette Flusskammer, drei zwei Zoll lange Abschnitte weichen Schlauchmaterials, ein männlicher und ein weiblicher 1/8-Zoll-Luer-Adapter, vier 1/2-Zoll-Schrauben mit Flachkopf, 6 5 16 Zoll, acht 30 Sekunden. Zollspuren pro Zoll, Schrauben mit Flachkopf, ein Paar Pinzetten, ein Objektträger und zwei mit Dampf sterilisierte Tücher.

Autoklavieren bei 121 Grad Celsius für 60 Minuten. Stellen Sie den Flusskreislauf, die Flusskammer, Vier-Wege-Hähne nacheinander als Einweghähne, Hahn und alle sterilisierten Teile auf dieses sterile Feld. Verbinden Sie unter Einhaltung steriler Technik die beiden Vier-Wege-Hähne.

Schließen Sie die offenen Probenanschlüsse mit Kapillaren. Trennen Sie die männlichen und weiblichen Anschlussadapter, die die beiden weichen Schlauchabschnitte des Durchflusskreislaufs verbinden, und setzen Sie die verbundenen Hähne ein. Befestigen Sie den in das Reservoir eingeführten weichen Schlauch an einer 30-Milliliter-Spritze und entfernen Sie den Spritzenkolben.

Füllen Sie die Flasche mit 125 Milliliter EPC-Medium. Schließen Sie den Weichschlauch wieder an den Hahn an. Setzen Sie einen sterilen Spritzenfilter in die Luftentlüftung ein.

Überführen Sie nun den Flusskreislauf in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Klemmen Sie das starre Rohr in den Masterflex-Rollenpumpenkopf, der für die Verwendung mit diesem Typ von Cole-Palmer-Schläuchen vorgesehen ist. Stellen Sie sicher, dass das Rohr nicht mit den Befestigungsschienen der Rollenpumpe überlappt.

Kennzeichnen Sie den Schlauch mit einem Markierstift dort, wo er auf beiden Seiten aus dem Pumpenkopf austritt. Nachdem sichergestellt wurde, dass alle Hähne in Richtung der Probenanschlüsse geschlossen und entlang des Durchflusskreislaufs geöffnet sind, starten Sie die Pumpe. Überprüfen Sie die Strömungsrichtung.

Das PERFUSE-Acht sollte vom Glasreservoir durch das starre Schlauchstück in den Pulsdämpfer fließen. Verwenden Sie zum Zusammenbau der Durchflusskammer sterile Handschuhe, um ein zwei Zoll langes weiches Schlauchstück mit einem ein Achtel Zoll großen weiblichen Luer-Adapter zu verbinden. Verbinden Sie ein weiteres zwei Zoll langes weiches Schlauchstück mit einem ein Achtel Zoll großen männlichen Luer-Adapter.

Verbinden Sie das zwei Zoll lange weiche Schlauchstück mit weiblichem Luer-Adapter mit dem Zulaufanschluss und das zwei Zoll lange weiche Schlauchstück mit männlichem Luer-Adapter mit dem Ablaufanschluss. Bringen Sie Vier-Wege-Hähne an beiden Luer-Adaptern an. Verbinden Sie das verbleibende zwei Zoll lange weiche Schlauchstück mit dem Seitenanschluss des Blasentrap und befestigen Sie einen Einweg-Hahn unter Verwendung steriler Pinzette.

Entfernen Sie die mit Zellen besiedelte Objektträgerplatte aus dem Zellkulturgefäß und legen Sie sie in die Aussparung auf der Unterplatte der Durchflusskammer. Stellen Sie sicher, dass die Seite mit den Zellen nach oben zeigt, und geben Sie mithilfe einer Spritze oder Pipette 10 Milliliter warmes EPC-Medium über die bebrütete Objektträgerplatte. Lassen Sie das Medium die Objektträgerplatte in der Durchflusskammer bedecken, verschütten Sie es jedoch nicht über den O-Ring auf der Unterplatte.

Platzieren Sie die obere Platte der Durchflusskammer auf der unteren Platte und richten Sie die Schraubenlöcher aus. Halten Sie die beiden Platten parallel, um keine Luftblasen in die Kammer einzubringen, während Sie die Platten zusammenschrauben. Entlüften Sie mithilfe eines automatischen, batteriebetriebenen Schraubendrehers die Einlass-Blasenfalle, indem Sie den Einweg-Sperrhahn am Anschluss der Einlass-Blasenfalle öffnen.

Spülen Sie das Zulaufrohr vorsichtig mit EPC-Medium unter Verwendung einer 10-Milliliter-Spritze aus und schließen Sie dann diesen Hahn ab und verschließen ihn mit einer Kappe. Entlüften Sie nun den Kammerkanal, indem Sie den Ablaufhahn mit Vierwegehahn öffnen und vorsichtig EPC-Medium durch die Durchflusskammer spülen. Verschließen Sie anschließend alle Anschlüsse des Vierwegehahns erneut mit einer 10-Milliliter-Spritze, setzen Sie die Kappen auf und schließen Sie sie ab.

Überführen Sie die Flusskammer in den befeuchteten Inkubator mit dem montierten Flusssystem. Halten Sie die Pumpe des Flusssystems an und verschließen Sie das Flusssystem. Schließen Sie die Hähne in Flussrichtung, um Leckagen zu verhindern.

Verbinden Sie die Durchflusskammer mit dem Durchflusskreislauf. Nachdem die Durchflusskammer mit dem Durchflusskreislauf verbunden wurde, öffnen Sie die Hähne in Fließrichtung. Starten Sie die Durchflusspumpe erneut und stellen Sie sicher, dass das PERFUSE eight in die korrekte Richtung fließt. Stellen Sie die Durchflussgeschwindigkeit auf die gewünschte Scherspannung ein.

Während des Durchflussversuchs kann die Durchflusskammer vom Kreislauf entfernt werden, um die Zellen mittels Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie abzubilden. Trennen Sie dazu die Durchflusskammer an den Verbindungen vom Hahn zum Hahn vom Durchflusssystem. Um acht Proben zur Analyse zu sammeln, sammeln Sie das Perfusat.

Zunächst stoppen Sie die Pumpe und schließen den Hahn, der dem Pulsdämpfer am nächsten liegt. Entfernen Sie die Schutzkappe und stellen Sie sie verkehrt herum ab, um eine Kontamination zu vermeiden. Führen Sie eine kleine Spritze in die Probenentnahmestelle ein.

Schließen Sie den Hahn in Richtung der Durchflusskammer, wobei der Probenanschluss und die Leitung in Richtung des Pulsdämpfers geöffnet bleiben. Ziehen Sie die gewünschte Menge an Probe aus dem Kreislauf, und schließen Sie den Hahn zum Probenanschluss, bevor Sie die Spritze entfernen. Lagern Sie die reichliche Acht-Probe in einem beschrifteten Vial und frieren Sie sie bei minus 80 Grad Celsius ein.

Schließen Sie den Probenanschluss wieder ab und stellen Sie sicher, dass alle Hähne geöffnet sind, bevor der Durchfluss beginnt. Mit dieser Methode können aus menschlichem Blut gewonnene endotheliale Progenitorzellen innerhalb von 15 Minuten auf Titanplättchen aufgebracht werden und haften unter physiologischen Scherkräften. Wie in dieser Abbildung gezeigt, vergrößern sich die EPCs unter dem Einfluss des Durchflusses von etwa 210 Quadratmikrometern unmittelbar nach der Aussaat auf etwa 657 Quadratmikrometer nach drei Stunden und auf etwa 1.152 Quadratmikrometer nach 48 Stunden Flüssigkeits-Scherstress von 15 Dyn pro Quadratzentimeter.

Dieses Lichtmikroskopbild veranschaulicht die zufällige Ausrichtung menschlicher EPCs. Nach einer statischen Anheftungsphase von sechs Stunden nach drei Stunden Fluss bei 100 dyn/cm² haben sich die Zellen ausgebreitet, behalten jedoch eine zufällige Orientierung bei. Nach 48 Stunden Fließscherbelastung bei 100 dyn/cm² sind die EPCs entlang der Strömungsrichtung ausgerichtet und orientiert.

Hier wurden EPCs mit CTO markiert und die Zellkerne mit Herx gefärbt, um nach dem Durchfluss zu sterben. Zu Vergleichszwecken zeigt dieses Bild porcine EPCs auf Titanrutschen, die entlang der Strömungsrichtung ausgerichtet sind. Nach 48 Stunden Strömung und einer Scherbelastung von 15 Dines pro Quadratzentimeter wurden die Zellgrenzen mit Anti-PCAM-Färbung und die Kerne mit Cytoxin-Nukleinsäurefärbung markiert.

Diese Methode ermöglicht es außerdem, Proben der PERFUSE eight zu vorbestimmten Zeitpunkten zu entnehmen, um sezernierte Zellmetaboliten zu analysieren und/oder zu quantifizieren. Hier ist ein Beispiel für die Produktion von Nitrit während eines 48-Stunden-Durchflussversuchs mit porcinen EPCs dargestellt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Sterilität während des gesamten Ablaufs aufrechtzuerhalten.

Außerdem ist es wichtig, die notwendigen Maßnahmen zu ergreifen, um die Anzahl der Luftblasen in der Flusskammer vor Beginn des kontinuierlichen Flusses zu reduzieren, da diese die Zellen abreißen können. Wir empfehlen außerdem, vor der Perfusion jede einzelne Verbindung in der Flusskammer und im Kreislauf auf Dichtheit zu überprüfen, um ein Austreten von PERFUSE eight während des Experiments zu verhindern. Diese Kammer ist mit integrierten O-Ringen konstruiert, die eine vollständige gegenseitige Abstützung der oberen und unteren Platten ermöglichen und eine dichte Abdichtung gewährleisten, ohne dass Vakuumpumpen erforderlich sind.

Dieses Merkmal gewährleistet zudem eine konstante Kammerhöhe zwischen den Experimenten und macht den Einsatz von Gummidichtungen oder Nachjustierungen überflüssig. Unsere Durchflusskammer verwendet standardisierte Objektträger. Daher stehen eine große Anzahl von Zellen für weitere Experimente zur Verfügung.

Beispielsweise können RNA und DNA von Zellen nach der Strömung auf Proteinsynthese oder Genexpression untersucht werden. Unser Schaltkreisdesign ermöglicht die Sammlung und Analyse von durchströmten acht Proben zur Quantifizierung von Zellmetaboliten wie Nitrit, einem primären oxidativen Metaboliten von Stickstoffmonoxid, das von Zellen unter Scherbelastung sezerniert wird. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man unsere Durchflusskammer und den sterilen Durchflusskreislauf zusammenbaut, um adhärente Zellen einer fluiden Scherbelastung auszusetzen.