High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode
9. Januar 2012
Bicellen sind Lipid / amphiphile Mischungen, die Membranproteine (MPs) halten in einer Lipid-Doppelschicht, sondern verfügen über einzigartige Phase Verhalten, das High-Throughput-Screening ermöglicht durch Kristallisation Roboter. Diese Technik hat erfolgreich eine Reihe von hochaufgelösten Strukturen von prokaryotischen und eukaryotischen Quellen erzeugt. Dieses Video beschreibt Protokolle zur Erzeugung der Lipid-Bicellen Mischung unter Einbeziehung Abgeordneten in die Bicellen Mischung, die Einrichtung von Kristalli
Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Einrichtung von Hochdurchsatz-Kristallisationsversuchen mit gereinigten Membranproteinen unter Verwendung von Lipic-B-Zellen. Zunächst werden B-Zellen durch Mischen eines Lipids und eines Detergens hergestellt, wobei das gereinigte Membranprotein in die B-Zell-Mischung eingebaut wird, und anschließend werden Kristallisationsversuche mithilfe eines Nanoliter-Roboters und visueller Inspektion durchgeführt. Die Verwendung eines Standard-Lichtmikroskops zeigt das Vorhandensein von Kristallen an.
Nach der Bildung können die Protein-Kristalle entnommen und zum Datensammeln sowie zur Strukturbestimmung eingefroren werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass aufgrund des einzigartigen Phasenverhaltens von B-Zellen Standardgeräte und im Labor verfügbare Robotik für die Kristallisation genutzt werden können. Die Einrichtung von B-Zellen ist eine so einfache Technik, dass sie es ermöglicht, das Zielmembranprotein aus dem detergenzhaltigen Milieu zu entfernen und in ein lipidbasiertes Medium zu überführen.
Dies liefert Ihnen einen völlig neuen Satz von Bedingungen für die Bildschirmanalyse. Es handelt sich um eine so einfache Methode, die bereits bei vielen Membranproteinen erfolgreich angewendet wurde, dass es einfach keinen Grund gibt, sie nicht auszuprobieren. Der erste Schritt bei der aus B-Zellen basierenden Kristallisation ist die Herstellung einer lipidären Amphimischung, die B-Zellen bildet.
Dieser Prozess erfordert erheblichen Aufwand und ist am zeitaufwändigsten. Beachten Sie, dass der Abschluss mehrere Stunden in Anspruch nehmen kann. B-Zellen können in einer Vielzahl von lipidären amphiphilen Kombinationen und über einen weiten Konzentrationsbereich hinweg entstehen.
Für empfohlene Ausgangspunkte siehe Tabelle eins im begleitenden schriftlichen Protokoll. Beginnen Sie damit, ein Milliliter der 35 %igen DMPC-Capso-Mischung im molaren Verhältnis 2,8 zu 1 herzustellen. Wiegen Sie hierzu 0,26 Gramm DMPC und 0,09 Gramm Chapo in einem Reaktionsgefäß ab. Füllen Sie die Mischung mit entionisiertem Wasser auf ein Volumen von 1,0 Milliliter auf und wirbeln Sie sie kräftig im Vortex.
Als Nächstes erwärmen Sie die Mischung in einem Wasserbad auf etwa 40 Grad Celsius, bis sie gelartig wird. Stellen Sie das Gefäß danach auf Eis. Die Probe sollte sich wieder verflüssigen.
Danach erneut einige Minuten lang vortexen und den Zyklus aus Erwärmen, Abkühlen und Vortexen so lange fortsetzen, bis das Lipid vollständig gelöst ist. Beachten Sie, dass die Mischung bei zunehmender Anzahl an Zyklen nach dem Abkühlen trüb werden kann. Die Mischung ist bei Raumtemperatur oder darüber ein klares Gel und auf Eis eine viskose Flüssigkeit; Zellen können für die Langzeitlagerung bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt werden.
Anschließend werden die gereinigten Proteine in das B-Zell-Medium eingearbeitet. Dies ist ein einfacher Vorgang, der am selben Tag wie die Kristallisation durchgeführt werden sollte, die im nächsten Abschnitt des Videos gezeigt wird. Tauen Sie die DMPC-Capso-B-Zell-Mischung bei Raumtemperatur auf, bis die Phase zu einem klaren Gel wechselt.
Stellen Sie die Mischung auf Eis, um sie zu verflüssigen, und wirbeln Sie sie kurz um, um eine homogene B-Zell-Phase wiederherzustellen. Ab diesem Zeitpunkt halten Sie die B-Zell-Mischung und das gereinigte Protein auf Eis. Dies hält die B-Zellen in einer flüssigen Phase, wodurch sie pipettierbar bleiben.
Fügen Sie als Nächstes das B-Zell-Gemisch im Verhältnis eins zu vier (Volumen pro Volumen) zu dem gereinigten, detergentenlöslichen Protein hinzu. Pipettieren Sie dann vorsichtig mehrmals auf und ab, bis die Lösung klar und homogen wird. Sollten Blasen entstehen, zentrifugieren Sie diese kurz in einer Tischzentrifuge ab.
Die Mischung mindestens 30 Minuten auf Eis inkubieren, um die vollständige Aufnahme des Proteins durch die Zellen zu fördern. Die Protein-durch-Zellen-Mischung ist nun bereit für Kristallisationsversuche. Die Kristallisationsversuche werden unter Verwendung eines Moskito-Kristallisationsroboters demonstriert.
Kühlen Sie eine 96-Well-V-Boden-Platte, indem Sie sie auf Eis stellen. Pipettieren Sie die Protein-zu-Zelle-Mischung in die Platte, um sicherzustellen, dass die Viskosität der Lösung minimal ist. Bewahren Sie die Protein-zu-Zelle-Mischung bis zum letzten Schritt auf Eis auf.
Der hier verwendete Roboter verfügt über fünf Plattformen. Stellen Sie die Mikroplatte mit dem Reservoir auf Plattform drei und den Kristallisationsdeckel, auf den die Tropfen abgegeben werden, auf Plattform fünf. Anschließend stellen Sie die Protein-by-Cell-Platte auf Plattform vier, die der Abgabeposition am nächsten liegt.
Dadurch wird sichergestellt, dass die Protein-durch-Zelle-Mischung als Letzte vom Roboter aufgenommen wird und sofort freigegeben wird. Starten Sie mit der Software den Durchlauf; der Roboter nimmt zunächst die Reservoirlösung und anschließend die Protein-durch-Zelle-Mischung auf und gibt beides als Tropfen auf den Deckel ab, um eine Erwärmung und eine Erhöhung der Viskosität während des Abgebens zu vermeiden. Programmieren Sie den Moskito nicht dazu, die Reservoirlösung unmittelbar nach Abschluss des Durchlaufs mit der Protein-durch-Zelle-Mischung zu vermischen.
Entfernen Sie die Protein-Tropfplatte aus dem Gerät und stellen Sie sie auf Eis. Entfernen Sie den Deckel vom Gerät und legen Sie ihn auf die Platte mit der Reservoirlösung, sodass sich die Tropfen in umgekehrter Position befinden. Inkubieren Sie die Platte bei 20 Grad Celsius.
Beachten Sie, dass auch andere Temperaturen zur Kristallbildung und Optimierung getestet werden können. Höhere Temperaturen induzieren die lamellare Phase, die den Vorteil bietet, das Protein vorab in Schichten zu organisieren. Temperaturen zwischen vier Grad Celsius und 20 Grad Celsius können untersucht werden.
Temperaturen unter vier Grad Celsius können dazu führen, dass die Lipide über längere Zeiträume ausfallen; die Kristallbildung ist am ersten und dritten Tag sowie danach wöchentlich mittels eines Standard-Lichtmikroskops zu überprüfen. Gezeigt sind hier ein Hellfeldbild und ein UV-Bild von nadelförmigen Kristallen, die unter der Bedingung „assault only“ beobachtet wurden. Es wurde keine Fluoreszenz von den Kristallen detektiert, was auf ein falsch-positives Ergebnis in diesem Bild hinweist.
Ein stabförmiger Kristall entstand, als Methylpropanediol als Fällungsmittel verwendet wurde. Der Kristall fluoreszierte schwach, was darauf hindeutete, dass es sich um einen Proteinkristall handeln könnte, erwies sich jedoch mittels Röntgenbeugung als nicht proteinhaltig. Dargestellt ist ein Kristall, der etwa vier Wochen nach dem Ansatz der Versuche beobachtet wurde.
Die starke Fluoreszenz unter UV-Licht bestätigt, dass es sich um einen Proteinkristall handelt. Wie Sie in diesem Video gesehen haben. Sobald B-Zellen verfügbar sind, können diese direkt mit dem gereinigten Protein gemischt werden, und ab diesem Punkt verläuft die Kristallisation nahezu identisch zu standardmäßigen, auf Detergenzien basierenden Protokollen.
Ein weiterer klarer Vorteil ist die Möglichkeit, B-Zellen mit spezifischen Lipiden zur Optimierung zu dotieren. Die Technik bietet wirklich große Vielseitigkeit und ist so einfach anzuwenden, dass sie bei allen Projekten zur Kristallisation von Membranproteinen eingesetzt werden sollte.
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Übersicht
Dieses Video demonstriert eine Methode zur Einrichtung von Hochdurchsatz-Kristallisationsversuchen gereinigter Membranproteine unter Verwendung lipidischer Bicellen. Die Technik ermöglicht die Einbindung von Membranproteinen in ein lipidbasiertes Medium und erleichtert dadurch den Kristallisationsprozess.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Strukturbiologie
- Kristallisation von Membranproteinen
- Biophysik
Hintergrund
- Bicellen sind Lipid/Amphiphil-Gemische, die Membranproteine in einer Lipiddoppelschicht stabilisieren.
- Diese Technik weist ein einzigartiges Phasenverhalten auf, das für die Hochdurchsatz-Screening-Methoden von Vorteil ist.
- Sie hat erfolgreich hochauflösende Strukturen aus verschiedenen Quellen hervorgebracht.
- Standard-Laborausrüstung kann für Kristallisationsversuche verwendet werden.
Zweck der Studie
- Die Herstellung von Bicellen für die Kristallisation von Membranproteinen demonstrieren.
- Aufzeigen, wie Membranproteine in die Bicell-Mischung eingebaut werden.
- Den Ablauf der Durchführung von Kristallisationsversuchen skizzieren.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Bicellen durch Mischen von Lipid und Detergens.
- Einbau gereinigter Membranproteine in die Bicell-Mischung.
- Kristallisationsversuche, durchgeführt mit einem Nanoliter-Roboter.
- Visuelle Überprüfung der Kristalle mittels eines Standard-Lichtmikroskops.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Bildung von Protein-Kristallen aus der Bicelle-Mischung.
- Kristalle können gewonnen und zum Datensammeln eingefroren werden.
- Die Technik ermöglicht eine effiziente Nutzung gängiger Laborgeräte.
- Hochdurchsatzfähigkeit verbessert den Kristallisationsprozess.
Schlussfolgerungen
- Bizellen stellen ein geeignetes Medium für die Kristallisation von Membranproteinen dar.
- Die Methode vereinfacht den Übergang von Proteinen aus detergenten in lipidreiche Umgebungen.
- Dieser Ansatz kann zu einer verbesserten strukturellen Aufklärung von Membranproteinen führen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Kristallisation von Membranproteinen stellt aufgrund der Hydrophobizität der Proteine und ihrer Instabilität in Detergenzmizellen weiterhin eine Engstelle in der strukturbasierten Wirkstoffentwicklung dar. Die lipidische Bicelle-Methode bietet eine natürlicheren lipidären Umgebung, die die Stabilität der Proteine und die Kristallqualität verbessert und somit zuverlässige strukturelle Daten für die Zielvalidierung ermöglicht. Dieser Ansatz unterstützt die frühzeitige mechanistische Ent风险bewertung, indem er hochauflösende Einblicke in Wirkstoff-Bindungstaschen und konformationelle Zustände ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Strukturbestimmung von Membranproteinen in einem lipidären Milieu, das die native Konformation und Ligandenbindungsstellen besser erhält.
- Operativer Wert: Verringert die Abhängigkeit von umfangreichen Detergens-Screenings, indem eine standardisierte lipidäre Matrix für Kristallisationsversuche bereitgestellt wird.
- Prädiktiver Wert: Hochwertige Kristalle unterstützen eine genaue Modellierung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen und erhöhen somit das Vertrauen in Hypothesen zur Zielstrukturenbindung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt kristalle von diffraktionsfähiger Qualität, die eine Auflösung auf atomarer Ebene für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung ermöglichen.
- Operativer Wert: Kompatibel mit standardmäßigen Nanoliter-Flüssigkeits-Handling-Robotern, wodurch eine Integration in bestehende Hochdurchsatz-Kristallisationspipelines möglich ist.
- Skalierbarkeit: Die geringe Viskosität der Bicelle-Protein-Gemische erleichtert die automatisierte Dosierung und verringert die technischen Hürden für die Automatisierung.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Mithilfe der Bicell-Kristallisation gewonnene Strukturen leiten die Entwicklung selektiver Inhibitoren mit verbesserten pharmakokinetischen Profilen.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Ermöglicht die Visualisierung konformationeller Zustände, die für allosterische Modulation und Gating-Mechanismen relevant sind.
- Relevanz für präklinische Modelle: Unterstützt die strukturbasierte Optimierung von Wirkstoffkandidaten, die krankheitsassoziierte Membranproteine aus verschiedenen Organismen gezielt ansprechen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Bicelle-Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung ein und liefert strukturelle Daten, die die medizinische Chemie und die Auswahl präklinischer Kandidaten unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem die Visualisierung der Membranproteinararchitektur und von Ligandenbindungsstellen in einer nahezu nativen Lipidumgebung ermöglicht wird.
- Screening: Erzeugt Kristallisationsbedingungen, die mit robotergestütztem Screening kompatibel sind, wodurch Durchsatz und Bedingungsabdeckung erhöht werden.
- Analytik: Liefert Röntgenbeugungsdaten, die Elektronendichtekarten für eine präzise Modellerstellung und die Validierung der Ligandenbindungsposition bereitstellen.
- Translationale Forschung: Verbindet atomare Strukturen mit funktionellen Assays und ermöglicht die Korrelation von Bindungsaffinität mit strukturellen Veränderungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bicell-Formulierungen können standardisiert und zur mehrfachen Verwendung an verschiedenen Membranproteintargets gelagert werden, wodurch die Reagenzienvariabilität verringert wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verbessert die Erfolgsrate der Kristallisation von Membranproteinen, indem die Umgebung der Lipiddoppelschicht nachgeahmt wird.
- Operativer Wert: Verwendet Standardlaborgeräte und Robotik und eliminiert so die Notwendigkeit spezialisierter Werkzeuge für hochviskose Medien.
- Strategischer Wert: Beschleunigt die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten, indem die Zeit bis zur Strukturaufklärung für anspruchsvolle Membranproteine verkürzt wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht datengestützte Go/No-Go-Entscheidungen auf Grundlage struktureller Erkenntnisse mit hoher Vertrauenswürdigkeit hinsichtlich der Arzneimittelwirksamkeit der Zielstrukturen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Lipiden und der Biochemie membranständiger Proteine, um die Verhältnisse von Lipid:Detergent und die Proteineinlagerung zu optimieren.
- Ist abhängig vom Zugang zu Kristallisationsrobotern und Inkubationssystemen mit kontrollierter Temperatur für die Durchführung und Überwachung der Versuche.
- Erfordert die Standardisierung der Bicelle-Herstellungsprotokolle zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen, um die Reproduzierbarkeit der Kristallisationsergebnisse sicherzustellen.
- Beinhaltet die Optimierung der Lipidzusammensetzung (z. B. DMPC:CHAPSO-Verhältnisse) sowie die Untersuchung verschiedener Fällungsmittel, um den protein-spezifischen Kristallisationsanforderungen gerecht zu werden.
- Ist durch den Bedarf an Kaltbehandlung während der Vorbereitung begrenzt, um die Flüssigkeit der Bicelle aufrechtzuerhalten und vorzeitige Phasenübergänge zu verhindern.
