Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Hallo und willkommen bei der Arbeitsgruppe für membranäre Struktur- und Funktionsbiologie. Mein Name ist Martin Caffery. Dies ist ein weiterer Artikel aus einer Reihe von JOVE-Artikeln zum Kristallisieren von Membranproteinen zur Strukturbestimmung mittels der in-meso- oder lipidischen kubischen Phasen-Methode.

Im ersten Artikel, JoVE 1 7 1 2, haben wir gezeigt, wie die proteinreiche kubische Phase hergestellt wird und wie die viskose und klebrige Mischphase manuell in Glas-Sandwich-Platten für Kristallisationsversuche abgegeben wird. Dieser Videoartikel beschreibt Methoden zur Verwendung eines In-meso-Kristallisationsroboters. Ein Roboter bietet die Vorteile von Geschwindigkeit, Genauigkeit, Präzision, Miniaturisierung und der Fähigkeit, über längere Zeiträume unter ungünstigen Bedingungen wie Dunkelheit oder niedrigen Temperaturen zu arbeiten.

Roboter können, wenn sie richtig eingesetzt werden, die Produktivität der Forschung zu Struktur und Funktion von Membranproteinen erheblich steigern. In diesem Videoartikel demonstrieren wir den Einsatz von drei kommerziell verfügbaren Robotern. Der erste Roboter wurde in der Arbeitsgruppe für membranäre Struktur- und Funktionsbiologie entwickelt und ist im Detail in Referenz eins beschrieben.

Die beiden anderen sind erst kürzlich verfügbar geworden und werden hier der Vollständigkeit halber aufgeführt. Die Vorbereitung der Kristallisationsplatte, um einen Kristallisationsversuch robotisch durchzuführen, beginnt mit der Vorbereitung der Basisplatte der in Glas-Sandwich-Bauweise hergestellten Kristallisationsplatte, die im Detail beschrieben ist. Auf die Basisplatte muss zunächst eine Silanisierung aufgebracht werden, und der perforierte doppelseitige Klebespacer, der die Vertiefungen bildet, muss auf die Platte aufgeklebt werden. Die hierfür benötigten Materialien sind hier dargestellt.

Sie umfassen eine Glas-Kristallisationsgrundplatte, einen perforierten Doppelseiten-Klebespacer mit Kristallisationslösung, ein Roll- oder Walzgerät, Papiertücher und einen Becher mit UE-Wasser. Die Platte wird auf ein Papiertuch auf einer Laborbank platziert. Einige Tropfen der Kristallisationslösung werden aufgetragen und dann mit einem Papiertuch gleichmäßig über die Oberfläche der Platte verteilt.

Die Platte wird von überschüssiger Silanisierungslösung befreit, indem sie vollständig in einen Becher mit Wasser eingetaucht wird. Die Platte wird aus dem Becher genommen, auf ein trockenes Papiertuch gelegt, mit der silanisierten Seite nach oben, und ihre freiliegende Oberfläche wird durch vorsichtiges Abtupfen mit Papiertüchern getrocknet.

Danach wird die Schutzabdeckung des perforierten doppelseitigen Abstandshalters entfernt, und der Abstandshalter wird auf der silanisierten Oberfläche der Glasplatte angebracht. Es ist wichtig, dass der Abstandshalter korrekt auf der Grundplatte positioniert wird, sodass die obere linke Ecke sowie die beiden angrenzenden Seiten des Abstandshalters und der Platte exakt übereinstimmen. Ein Roller oder Präzisionszylinder wird verwendet, um den Abstandshalter auf der Grundplatte zu glätten und eine dichte Verbindung zwischen beiden zu erzeugen.

Beiläufig bemerken wir, dass siloisierte Platten zusammen mit perforierten Abstandshaltern gemäß dem im Referenzabschnitt Beschriebenen kommerziell erhältlich sind. Nachdem wir die Kristallisationsgrundplatte vorbereitet haben, schreiten wir als Nächstes zur Einrichtung und Nutzung des In-meso-Roboters fort. Wie im Folgenden erläutert, demonstrieren wir die Verwendung von drei In-meso-Robotern.

In allen gezeigten Fällen werden die Roboter in einem temperaturgeregelten Raum betrieben, der auf 20 Grad Celsius eingestellt ist, und zwar im Meso-Roboter eins, dem ersten Meso-Roboter, der in diesem Video vorgestellt wird. Der Artikel wurde im Labor des leitenden Wissenschaftlers entwickelt und ist nun kommerziell erhältlich. Vollständige Einzelheiten finden sich im Referenzabschnitt.

Die Materialien und Geräte, die für die robotergestützte Einrichtung eines Kristallisationsversuchs benötigt werden, sind hier dargestellt. Dazu gehören ein Laborbuch, mit Protein beladene Mease, frisch hergestellt wie in JoVE-Artikel 1 7 1 2 beschrieben und in einer Hamilton-Spritze aufbewahrt, silanisierte Basisplatten mit Abstandshaltern und passendem Deckglas, eine Wasserflasche und Tücher sowie der in Miso-Roboter.

Die erste Ansicht zeigt den Roboter mit freiem Deck. Die nächste Ansicht zeigt den Roboter vollständig bestückt mit der Befeuchtungsstation, der Kristallisationsgrundplatte und dem Deep-Well-Block, der die Fällungslösungen enthält. Wir beginnen die Einrichtung, indem wir die Grundplatte auf das Deck des Roboters stellen.

Es verfügt über eine eigene Plattform, die eindeutig mit Positionen für die Brunnen gekennzeichnet ist, um die Ausrichtung der Basisplatte zu ermöglichen. Die Platte sollte zur Identifizierung eindeutig beschriftet sein. Der 96-Loch-Block, der die Präzipitanzlösungen enthält, ist auf einer eigenen Plattform auf dem Deck des Roboters neben der Kristallisationsplatte befestigt.

Der Block wird geöffnet, indem die Kunststoffdeckelkappe vorsichtig abgezogen wird. Der Feuchtigkeitsstrom aus dem Luftbefeuchter wird so gelenkt, dass er über die Basisplatte auf der Oberfläche des Roboters strömt, während der Roboter eingerichtet wird. Der Roboter wird gemäß den Herstelleranweisungen initialisiert.

Dies wird hier nicht im Detail demonstriert, da sich die genauen Protokolle im Laufe der Zeit ändern können. Im Wesentlichen erfolgt während der Initialisierung die Bereitstellung von Referenzpositionen in drei orthogonalen Richtungen, x, Y und Z, für den Mease-Dosierarm des Roboters. Anschließend wird die mit Protein beladene Meza-Phase in einer Hamilton-Spritze inklusive Dosierkanüle an Arm eins des Roboters befestigt. Detaillierte Angaben zur Herstellung der Meza-Phase und der Spritze finden sich in JoVE-Artikel 1 7 1 2 sowie in Referenz eins. Die Nadelspitze der Dosierspritze muss nun mit dem Boden und der Mitte des obersten Wells in der linken Ecke der Kristallisationsplatte ausgerichtet werden. Dies entspricht dem Well-Identifier A1, wobei die Ausrichtung mit dem Boden von Well A1 als erste Maßnahme erfolgt.

Dies geschieht, indem man nach dem Aussenden mit dem Arm die Höhe oder die Z-Koordinate beobachtend anpasst, wie nahe die Nadelsspitze an den Boden des Wells kommt. Dass die Spitze gerade den Boden des Wells berührt, kann beurteilt werden, indem man die Platte manuell von Seite zu Seite auf der Plattform verschiebt, während man die Höhe des Aussende-Arms ganz leicht anpasst; die Z-Koordinate des Aussende-Arms, bei der die Spitze die Platte berührt, wird in den Computer eingegeben. Die Aussendung wird so programmiert, dass die Nadelsspitze um mehrere Mikrometer von dieser Referenz-Z-Position entfernt ist, was der Oberfläche der Basisplatte entspricht. Anschließend wird der Roboter aktiviert, um eine Reihe von vom Benutzer ausgelösten Schritten durchzuführen, um die Nadelsspitze in der Mitte des Wells A1 zu positionieren.

Die Referenz-XY-Koordinate des Abgabearms, an der die Spitze zentriert ist, wird im Computer, der den Roboter steuert, gespeichert. Sie dient dazu, die Mitte der verbleibenden Wells auf der Platte zu definieren. Nachdem diese Referenzkoordinaten im Computer festgelegt wurden, erhält der Mease-Abgabearm die Anweisung, in seine Ausgangsposition zurückzukehren und dabei die Spritze zu befüllen.

Die Dosierspritze muss nun geprimt werden. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass frische Mease die Dosierkanüle füllt und die erste Vertiefung der Platte ihre vollständige Menge an Mease erhält. Im Programm, das die Roboteraktivierung steuert, befindet sich ein Befehl zum Primen.

Es bewirkt, dass sich der Kolben in der Spritze schrittweise unter Benutzerkontrolle vorwärts bewegt. Währenddessen wird die Nadelspitze daraufhin überprüft, ob Mease austritt; die extrudierte Mease-Phase wird mit einem Tuch entfernt. Damit ist der Vorbereitungsvorgang des Roboters abgeschlossen.

Der Roboter ist nun betriebsbereit und kann im automatischen Modus mit der Durchführung der Analyse beginnen. Das Robot-XAP-Programm initiiert eine Reihe von Spülschritten, bei denen die Tropfspitzen für das Fällungsmittel am Arm zwei des Roboters gereinigt werden. Anschließend werden diese vorbereitet, um Fällungslösungen aus dem Deep-Well-Block aufzusaugen. Durch Aktivierung der Dosierfunktion am Roboter wird die sequenzielle Befüllung der Vertiefungen in Gang gesetzt: zunächst jeweils acht Vertiefungen mit proteinhaltiger Mease, gefolgt von Fällungslösungen zwischen den einzelnen Applikationen. Danach kehrt der Mease-Dosierarm in eine Parkposition zurück, bei der die Nadelspitze in einem angefeuchteten Schwamm platziert wird, um zu verhindern, dass die Mease an der Spitze austrocknet.

Am häufigsten werden bei Kristallisationsversuchen, die in der Arbeitsgruppe für Struktur- und Funktionsbiologie durchgeführt werden, 50 Nanoliter Mease und 800 Nanoliter Präzipitationslösung verwendet. Das Programm, das den Roboter in dieser Demonstration steuert, wurde so eingerichtet, dass sich beide Arme gleichzeitig bewegen.

Auf diese Weise ist es möglich, das Beladen einer 96-Loch-Platte mit Mease und Präzipitant innerhalb von fünf Minuten abzuschließen. Unmittelbar nachdem die Platte gefüllt ist und die Roboterarme in ihre Parkpositionen zurückgekehrt sind, wird die Platte vom Deck des Roboters entfernt und auf eine ebene, feste Oberfläche gestellt.

Ein Deckglas wird vorsichtig auf die Basisplatte gelegt, sodass es mit der oberen klebrigen Oberfläche des Abstandshalters in Kontakt kommt. Es ist wichtig sicherzustellen, dass alle 96 Vertiefungen vollständig abgedeckt sind, dass das Deckglas exakt parallel zur Basisplatte ausgerichtet ist und dass kein Teil des Deckglases über die Grundfläche der Basisplatte hinausragt. Ein Roller oder Präger wird verwendet, um eine feste und gleichmäßige Verbindung zwischen dem Deckglas und dem Abstandshalter herzustellen.

Die Platte sollte an dieser Stelle überprüft werden, um sicherzustellen, dass der Versuchsaufbau wie vorgesehen verlaufen ist. Gesucht wird ein Aussehen, das an ein Spiegelei in der Pfanne erinnert. In jedem Brunnen entspricht das Eigelb der Meza-Phase.

Das Eiweiß ist die Fällungslösung, und der Rand der Pfanne stellt den Randgebiet der Kristallisation dar. Im Idealfall sind die drei konzentrisch angeordnet. Die Platte ist nun bereit, in einem temperaturgeregelten Lagerbereich für das Kristallwachstum aufgestellt zu werden.

Falls keine weiteren Platten mehr eingerichtet werden sollen, sollte der Präzipitationsblock vom Deck des Roboters entfernt, ordnungsgemäß verschlossen und wieder in die Lagerung zurückgestellt werden. Die Spritze, die die Mease enthält, wird vom Dosierarm des Roboters entfernt, in ihre verschiedenen Teile zerlegt, einschließlich Dosierkanüle und Ferial. Sorgfältig mit Methanol gewaschen und zur Vorbereitung auf die nächste Verwendung im Meso-Roboter zwei Moskito LCP getrocknet.

Der nächste Videoclip zeigt den Moskito-LCP-Roboter, der für die Einrichtung von in-meso-Kristallisationsversuchen verwendet werden kann. Er verfügt über ein ähnliches Meph-Phasen-Dosiersystem wie das zuvor in diesem Artikel beschriebene. Bei Roboter eins wird das Fällungsmittel jedoch mit Einwegspitzen dosiert.

Das Instrument selbst ist hier dargestellt. Es umfasst eine Plattform, auf der die Kristallisationsplatte und der Präzipitantenblock positioniert sind, sowie eine Kammer mit Fenstern zur Kontrolle der Luftfeuchtigkeit. In dieser Ansicht wurden die Fenster der Feuchtekammer geöffnet, außerdem ist eine Spule mit Dosierspitzen, ein dosierender Arm und ein lasersbasierter Sensor zur Bestimmung der Position der Trennflüssigkeits-Nadel sichtbar.

Eine erhöhte Plattform, auf der die Kristallisationsplatte sitzt, und eine versenkte Plattform zur Aufnahme des Präzipitant-Screen-Blocks. In dieser Abfolge hat der Roboter eine Initialisierungssequenz von Aktionen durchlaufen, sobald das Gerät eingeschaltet wird. Mit Hilfe einer Programmier-Software wird das Gerät für die Arbeit mit bestimmten Kristallisationsplatten und Präzipitant-Blöcken eingerichtet und zur Dosierung definierter Volumina von Mease und Präzipitant in einer vorgegebenen Reihenfolge genutzt.

Solche Einzelheiten werden vom Hersteller bereitgestellt und hier nicht dargestellt. Die Verwendung des Roboters zur Vorbereitung einer Kristallisationsplatte beginnt wie folgt: Eine Hamilton-Spritze, komplett mit Nadel und gefüllt mit proteinhaltigem Mes, wird wie oben unter „in meso robot one“ und in JoVE 1 7 1 2 beschrieben vorbereitet. Die Spritze wird unter dem Dosierarm des Roboters in einer Halterung befestigt.

Die X- und Y-Koordinaten der Nadel an der Dosierspritze werden mithilfe des am Deck montierten Lasersensors bestimmt. Dieser Schritt ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Mease genau in der Mitte jedes Wells der Kristallisationsplatte abgegeben wird. Mit einem Knopfdruck auf dem Bedienfeld wird die Spritze entlüftet, um Mease aus der Nadelspitze auszustoßen.

Das extrudierte Mease wird anschließend mit einem Tuch entfernt, um die Verwendung des Roboters zum Befüllen der Vertiefungen vorzubereiten, bevor die Kristallisationsplatte auf der Robotereinheit montiert wird. Die Oberfläche der Plattform wird mit einigen Tropfen Wasser angefeuchtet, um die Platte an ihrem Platz zu halten. Über Kapillarwirkung wird die Schutzabdeckung von der Platte entfernt, und die Platte wird fest auf ihrer Plattform platziert, um eine gute Haftung sicherzustellen.

Es gibt drei Referenzmarken auf der Plattform, über denen die drei Eck-Vertiefungen zentriert sind, um eine korrekte Positionierung der Platte bezüglich der Spitze der Dosierkanüle sicherzustellen; das Gerät ist nun bereit, einen Einrichtungszyklus zu beginnen. Dieser beginnt mit einem zweiten Ansaugschritt, bei dem Mease auf eine kleine Glasplatte abgegeben wird, unmittelbar bevor das Gerät zur Beladung der Platte mit frischem Mease übergeht. In dieser Abfolge sehen wir, wie der Roboter zunächst mit Mease belädt, und zwar eine vertikale Spalte mit acht Vertiefungen auf der Platte, und anschließend Einmalkapillaren verwendet, um Präzipitationslösung auf den Mease-Tropfen aufzutragen.

Dieser Vorgang wird 11-mal entlang der Länge der Platte wiederholt, bis alle Vertiefungen gefüllt sind. Der gesamte Vorgang dauert etwa fünf Minuten. In diesem speziellen Video wurden in jede Vertiefung 50 Nanoliter Mease und 800 Nanoliter Fällungsmittel-Lösung pipettiert.

Die gefüllte Platte wird vom Plattformroboter, der auf einem Tisch steht, entfernt. Das Deckglas wird aufgelegt und die Platte wie oben unter Miso-Roboter eins beschrieben mit einem Büstenhalter versiegelt. Die ordnungsgemäß beschriftete Platte kann nun in einer temperaturgeregelten Umgebung für das Kristallwachstum in Meso-Roboter drei, dem Griffin LCP, platziert werden.

Dieser letzte Videoclip zeigt den Griffin-LCP-Roboter bei der Einrichtung von in-meso-Kristallisationsversuchen. Der Griffin verfügt über ein ähnliches System zur Dosierung der Meph-Phase wie das oben für Roboter eins beschriebene. In diesem Fall werden jedoch alle 96 Fällungsmittellösungen gleichzeitig dosiert.

Das Instrument selbst ist hier dargestellt. Es umfasst eine Plattform, auf der die Kristallisationsplatte und der Präzipitantenblock stehen, einen Dosierarm und einen Phoenix-96-Tip-Kopf. Zur Abgabe von Präzipitatenlösungen wird der Roboter in Aktion in dieser abschließenden Videosequenz gezeigt.

Der 96-Tip-Kopf wird zunächst mit Präzipitatorlösung beladen. Eine benutzerdefinierte Verzögerung ermöglicht das Ansaugen viskoser Präzipitanzien. Die MEA-Phase wird nacheinander in die 96 Vertiefungen ausgegeben, wobei der Vorgang etwa eine Minute dauert.

Schließlich gibt der 96-Kopf alle 96 Präzipitationslösungen gleichzeitig auf die MEA-Phasenbolusse in den Kristallisationsmulden ab. Der gesamte Plattenbeladeprozess wird innerhalb von zwei Minuten abgeschlossen. Die befüllte Platte wird vom Deck des Roboters entfernt, mit einer Deckglasabdeckung verschlossen und zur Kristallbildung unter kontrollierten Temperaturbedingungen gelagert.

Die nächsten Schritte im Gesamtprozess der Strukturaufklärung mittels makromolekularer Kristallographie sind das Ernten und kryogene Abkühlen der Kristalle sowie die Aufnahme und Verarbeitung von Röntgenbeugungsdaten an ihnen. Diese Themen werden in separaten JoVE-Artikeln dieser Reihe behandelt.