Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

Hallo, ich bin Jersey. Hi, mein Name ist Shabi, und wir sind beide Postdoktoranden am Imperial College of London, wo wir mit Professor Andrew Di Melo und Dr. Josh Del an mikrofluidischen Tropfenplattformen arbeiten. Mikrofluidische Plattformen auf Tropfenbasis sind vielversprechende Kandidaten für Experimente mit höherer Durchsatzleistung, da sie in sehr hohen, präzise definierten Volumina erzeugt werden können, und ihre Erzeugungsfrequenz kann bis zu mehreren Kilohertz betragen.

Außerdem können, da der interessierende Bereich in Kompartimente von nur wenigen Litern Größe eingeschlossen werden kann, sowohl Übersprechen als auch Dispersion eliminiert werden, und analytische Prozesse können genauer zeitlich gesteuert werden. In unserer Arbeitsgruppe haben wir mikrotröpfchenbasierte Plattformen bereits erfolgreich für zahlreiche Anwendungen implementiert. Beispielsweise für die Polymerase-Kettenreaktion, die Synthese von Nanopartikeln und den Einzelmolekül-Zell-Assay.

Die großen Datenmengen, die in diesen Systemen erzeugt werden, müssen effizient extrahiert, genutzt und verarbeitet werden. In dieser Hinsicht sollte die gewählte Nachweismethode geeignet sein, eine hohe Empfindlichkeit und niedrige Nachweisgrenzen aufweisen, auf eine Vielzahl molekularer Spezies anwendbar sein, zerstörungsfrei arbeiten und sich einfach mit mikrofluidischen Vorrichtungen kombinieren lassen. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir eine Reihe experimenteller Werkzeuge und Protokolle entwickelt, die es ermöglichen, große Mengen physikalischer Informationen aus Umgebungen mit geringem Volumen zu gewinnen und die zur Analyse einer breiten Palette physikalischer, chemischer und biologischer Tors anwendbar sind.

In diesem Protokoll stellen wir zwei Methoden vor, die zur Detektion einzelner Zellen und zur Abbildung von Mischprozessen in Dropbox angewendet werden. Mikrofluidische Chips werden traditionell aus polydimethylsiloxan (PDMS) mittels Photolithographie-Methoden hergestellt. Dieser Prozess sollte in einer Reinraumumgebung durchgeführt werden, um mikrofluidische Kanäle herzustellen. Spinco, SU 8 50 auf einem Siliziumwafer, weiches Backen auf einer Heizplatte bei 65 Grad und 95 Grad, um das Lösungsmittel zu verdampfen und den Film nach dem Abkühlen zu verdichten, anschließend das SU 8-Resist mit UV-Strahlung unter der geeigneten Maske belichten und danach den Wafer nach dem Abkühlen bei 65 Grad und 95 Grad backen.

Entwickeln Sie die nicht belichteten Bereiche unter Rühren mit der geeigneten Entwicklerlösung. Spülen Sie den Wafer mit frischem EC-Lösungsmittel und trocknen Sie ihn anschließend unter Gas, um eine saubere Oberfläche zu erhalten. Behandeln Sie den Wafer mit Hexan- und Methanolwäschen.

Außerdem, um den Herstellungsprozess der Negativform abzuschließen, verdampfen Sie 40 Minuten lang ein Haftvermittler auf die Oberfläche in einem Trockenschrank. Um strukturierte mikrofluidische Substrate herzustellen, mischen wir S guard 1 8 4 im Verhältnis 10 zu 1 aus Harz und Vernetzer und gießen dies über die Negativform. Entgasen Sie dies in einem Trockenschrank und härten Sie das Bauteil bei 65 Grad aus.

Schneiden Sie das ausgehärtete PDMS aus und lösen Sie es vom Master ab. Erstellen Sie Zugangsöffnungen für die Fluidikschläuche mithilfe einer Biopsiepunch. Härten Sie eine weitere PDMS-Schicht 20 Minuten bei 65 Grad aus.

Platzieren Sie die vorbereitete obere Schicht auf der unteren Schicht und härten Sie sie über Nacht bei 65 Grad aus. Lösen Sie die Chips aus der Petrischale und schneiden Sie sie in Würfel. Sobald die Chips hergestellt sind, können sie verwendet werden, indem die gewünschten Lösungen eingefüllt werden.

Füllen Sie die Spritzen mit den erforderlichen Lösungen und stellen Sie sicher, dass sich in keinem Teil der Schläuche keine Luftblasen befinden. Für die Tropfenerzeugung werden zwei Phasen verwendet. Die wässrige dispergierte Phase enthält die gewünschten Reagenzien.

Die Ölphase fungiert als kontinuierliche Phase; passen Sie Schläuche mit dem gleichen Innendurchmesser wie die Spritzenkanülen an einem Ende an die Kanülen an, montieren Sie die Spritzen auf einer Spritzenpumpe und legen Sie die gewünschte Infusionsflussrate fest. Für jede Phase wird ein minimales Verhältnis von Ölauftriebs- zu wässrigen Flussraten von eins empfohlen, um eine Benetzung des PDMS durch die wässrige Phase zu vermeiden, was zu einer instabilen Tropfenbildung führen würde. Verbinden Sie die anderen Enden der Schläuche direkt mit den in das PDMS-Substrat gestanzten Löchern.

Für komplexere Lösungen können auch Silica, Kapillaranschlüsse oder -verbinder eingesetzt werden. Verbinden Sie den Auslassanschluss des Chips mit der Schlauchleitung und leiten Sie diese in einen Sammelbehälter zur Entsorgung oder weiteren Analyseverarbeitung. Sobald dies eingerichtet ist, gibt es zwei Hauptkonfigurationen von Mikrokanälen, um Tröpfchen zu erzeugen: Flussfokussierung oder ein T-Kreuzungsformat, die sich aus den Scherkräften ergeben, die entstehen, wenn diese Geometrien verwendet werden, um die beiden zulässigen Flüssigkeiten zusammenzuführen, sowie aus den anschließend an der Grenzfläche auftretenden kapillaren Effekten.

Einzelne Tropfen mit einem Volumen von nur wenigen Femtolitern werden spontan dispergiert. Sobald die Tropfen erzeugt werden, können sie mithilfe einer optischen Anordnung untersucht werden. Das optische System wird gemäß dem folgenden Protokoll eingerichtet.

Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit automatisierter submikronaler Positionierungsfähigkeit und einem Laser, der bei einer Wellenlänge arbeitet, die der Absorption der beteiligten Fluorophore entspricht. Verwenden Sie zur Anregung einen Impulslaser, der mit Wiederholungsraten von mehreren Megahertz für die fluoreszenzlebensdauerabbildende Mikroskopie arbeitet. Bei Experimenten mit Phlegm werden Strahlablenkspiegel und Optiken verwendet, um die Strahlhöhe sowie die Strahlrichtung zu steuern.

Verwenden Sie einen dichroitischen Spiegel, um den Laserstrahl in die Objektivlinse zu reflektieren. Falls zwei Laser gleichzeitig verwendet werden, kann ein Dual-Band-dichroitischer Spiegel installiert werden. Um die Reflexion der beiden Laserstrahlen zu ermöglichen, verwenden Sie ein auf Unendlich korrigiertes Mikroskopobjektiv mit hoher numerischer Apertur (NA), um das Laserlicht in einem Mikrofluidikkanal stark zu fokussieren.

Sammeln Sie die von der Probe im mikrofluidischen Kanal emittierte Fluoreszenz mit dem gleichen Objektiv mit hoher numerischer Apertur und leiten Sie sie über denselben dichroitischen Spiegel. Entfernen Sie verbleibendes Anregungslicht mithilfe eines Einzel- oder Doppelband-Emissionsfilters. Fokussieren Sie die Fluoreszenzemission auf eine 75-Mikrometer-Blende.

Unter Verwendung einer plan-konvexen Linse. Positionieren Sie das Lochblende in der konfokalen Ebene des Mikroskopobjektivs. Verwenden Sie einen weiteren dichroischen Spiegel, um das fluoreszierende Signal auf zwei Detektoren aufzuteilen.

Filtern Sie die von dem Dichroischen Spiegel reflektierte Fluoreszenz mit einem Emissionsfilter und fokussieren Sie sie mit einer plan-konvexen Linse auf den ersten Detektor. Bei Experimenten, die einen sekundären roten Fluor beinhalten, filtern Sie die durch den Dichroischen Spiegel transmittierte Fluoreszenz mit einem weiteren Emissionsfilter und fokussieren Sie sie anschließend mit einer weiteren plan-konvexen Linse auf den zweiten Detektor. Verwenden Sie Avalanche-Photodioden zum Nachweis von Fluoreszenzphotonen.

Koppeln Sie für die Erfassung der Fluoreszenzdaten das elektronische Signal des Avalanche-Photodiodendetektors an ein multifunktionales DAQ-Gerät zur Datenaufzeichnung, das auf einem Personalcomputer läuft. Verwenden Sie für Experimente mit Phlegma einen Impuls-Laser und schließen Sie die Detektoren an eine zeitkorrelierte Einzelphotonenzählkarte (TCS-PC-Karte) an, die auf einem separaten PC läuft. Diese Karte ermöglicht die Erfassung von Fluoreszenzlebensdauerdaten.

Unter Verwendung einer TCS-PC-Methode. Jedes detektierte fluoreszierende Photon wird mit einem einfallenden Laserimpuls korreliert, und daher wird jedem emittierten Fluoreszenzphoton eine Verzögerungszeit zugeordnet. Diese Daten können mit einer einfachen oder multiexponentiellen Abklingkurve angepasst werden, um eine Schätzung der radiativen Rate der Fluorophore zu erhalten.

Heute wissen wir, dass Zellen aus biologischer, physikalischer und chemischer Sicht stark heterogen sind. Daher sollten wir idealerweise jeweils eine einzelne Zelle analysieren. Die Analysen müssen jedoch mit einer höheren Durchsatzleistung durchgeführt werden, damit wir ausreichend quantitative Informationen sammeln können, um zu einer zuverlässigen und aussagekräftigen Schlussfolgerung zu gelangen.

Hier haben wir ein Beispiel für die Einschließung von E. coli-Zellen in eine einzelne Tröpfchenphase, sodass dies durchgeführt werden kann. Verwenden Sie den E. coli-Stamm Top 10, der über Nacht kultiviert wurde. Um die Vitalität der Zellen nachzuweisen, verwenden Sie Cyto Nine und Propidiumiodid.

Beide Farbstoffe sind DNA-interkaliierende Farbstoffe, und ihre Fluoreszenzintensität steigt um mehr als das 20-Fache an. Cytotin ist ein grün fluoreszierender, membranpermeabler Farbstoff, der an DNA bindet, während Propidiumiodid ein rot fluoreszierender, membranimpermeabler Farbstoff ist.

Lebende Zellen fluoreszieren daher grün, während tote Zellen sowohl grüne als auch rote Emissionen aufweisen. Hier sehen wir die Tropfenbildung und die Einzelzell-Verkapselung mittels einer T-Kreuzung. Das Video wurde mit einer Hochgeschwindigkeitskamera aufgenommen, doch die Tropfen können mit einer Rate von mehreren Tausend pro Sekunde erzeugt werden.

Bei der Einschließung von Zellen muss sichergestellt werden, dass die Zellkultur so verdünnt ist, dass sich weniger Zellen als Tröpfchen erzeugen, und dass ein Absinken der Zellen, das in der Spritze oder in Schläuchen auftreten kann, verhindert wird. Verwenden Sie einen magnetischen Rührstab in der Spritze, um die Zellen gleichmäßig in der Lösung verteilt zu halten. Nutzen Sie sehr dünne Schläuche mit einem Durchmesser von 50 Mikrometern, um die Spritze mit dem Mikrochip zu verbinden.

Dies gewährleistet eine hohe Durchflussgeschwindigkeit innerhalb der Schläuche und verhindert somit, dass sich die Zellen absetzen. Hier sind typische Beispiele für Photozählungen in Abhängigkeit von der Zeit für zellbasierte Experimente. Zur Abbildung der Mischvorgänge innerhalb von Tröpfchen.

Tröpfchen können unter Verwendung zweier verschiedener Fluorfarbstoffe mit unterschiedlichen Lebensdauern erzeugt werden. Innerhalb eines fließenden Tröpfchens entsteht ein Strömungsfeld, das schließlich die beiden ursprünglich getrennten Lösungen vermischt und so den Mischvorgang verstärkt. Die Symmetrie des Strömungsfeldes kann durch die Verwendung gewundener Kanäle verändert werden.

Um die Tröpfchen zu untersuchen, fokussieren Sie das optische Messvolumen auf halber Höhe eines Mikrokanals, entlang dessen sich Tröpfchen bewegen, beginnend an einer Seite des Kanals, und führen Sie jedes Experiment über die gesamte Breite des Kanals durch. In Ein-Mikrometer-Abständen. Implementieren Sie einen Algorithmus, um einzelne Signalausschläge, die mit Tröpfchen assoziiert sind, von dem Rauschhintergrund der Ölphase zu unterscheiden und die Dauer jedes Ausschlags zu bestimmen.

Implementieren Sie einen zweiten Algorithmus, um die Verzögerungszeit und die Intensitätswerte entlang der Länge jedes Tröpfchens bei der jeweiligen Breite zu extrahieren, bei der das Experiment durchgeführt wurde. Verwenden Sie anschließend einen Maximum-Likelihood-Schätzer (MLE-Algorithmus), um die Fluoreszenzlebensdauer jedes Tröpfchens im Experiment zu bewerten. Die Mittelung der Lebensdauerwerte aller Tröpfchen im Experiment verringert den endgültigen Fehler der MLE-Berechnung.

Je mehr Tröpfchen untersucht werden, desto geringer ist der Fehler, sobald eine Lebensdauer-Trajektorie ermittelt wurde. Kombinieren Sie für jede Breite alle Trajektorien in einer zweidimensionalen Karte. Da jedem Lebensdauerwert eine bestimmte Mischung der beiden Flora-Fours zugeordnet ist, kann somit eine Konzentrations- oder Mischkarte erhalten werden.

Wir haben die Herstellung eines Mikrogeräts sowie den experimentellen Aufbau und die zugehörigen Protokolle zur Bildung von Mikrotropfen, deren räumliche Einschließung und optischer Detektion beschrieben. Die beiden ausgewählten Beispiele – die Detektion einzelner Zellen in Tropfen und die Abbildung der Mischvorgänge innerhalb fließender Tropfen – stellen gängige Anwendungen dar, die derzeit mittels Tropfenmikrofluidik untersucht werden.

Wie die vorgestellten Experimente zeigen, weisen Tropfen-Mikrofluidik-Plattformen bestimmte attraktive Eigenschaften auf, wie hohe Durchsatzraten aufgrund der perfekten Einsperrung und höhere Reproduzierbarkeit. Die große Menge an erzeugten Informationen und die hohe Geschwindigkeit, mit der diese Informationen generiert werden, erforderten den Einsatz schneller Detektionsmethoden mit höchster räumlicher und zeitlicher Auflösung, um den vollen Vorteil dieser miniaturisierten Plattformen nutzen zu können.

In diesem Fall zeigen wir, dass dies mithilfe hochpräziser fluorer Spektroskopietechniken möglich ist.