Visualization of Vascular Ca ^{2 +} Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, vaskuläre Kalziumsignale sichtbar zu machen, die durch perikrin gebildete reaktive Sauerstoffspezies oder r os ausgelöst werden. Dies wird erreicht, indem zunächst r os mit oxidationsempfindlichen Farbstoffen in aktiven Makrophagen visualisiert werden. R os können auch in endothelialen Zellen mithilfe plasmidbasierter fluoreszierender Sensoren dargestellt werden.

Anschließend erfolgt die simultane Visualisierung von mit Cell Tracker Red markierten aktivierten Makrophagen und fluoreszenzmarkierten Endothelzellen in einem Kokultursystem. Schließlich wird die durch Makrophagen-abgeleitete ROS ausgelöste Kalziumsignalisierung in Endothelzellen mittels eines konfokalen Abbildungssystems gemessen.

Diese Ergebnisse können ROS-Spiegel unabhängig voneinander sowie gleichzeitig die durch Peregrine-induzierte ROS-vermittelte intrazelluläre Calciummobilisierung nachweisen. Diese Methode ermöglicht die simultane Erfassung von zwei verschiedenen Signalmolekülen, die eng miteinander eine vaskuläre Signalgebung und eine pathophysiologische Simulatorsituation auslösen. Zwei Postdocs in meinem Labor, Karthik und Raj, werden das Verfahren anhand von Roh- und Kalziummessungen sowie der Interaktion zwischen Makrophagen und endothelialen Zellen demonstrieren.

Kultivieren Sie aus Monozyten stammende Makrophagen der Maus in 35-Millimeter-Kulturschalen mit Glasboden. Dann behandeln Sie die Zellen mit Agonisten des Toll-ähnlichen Rezeptors und inkubieren sie sechs Stunden bei 37 Grad Celsius. Zur Visualisierung des zytosolischen.

Fügen Sie einen oxidationsempfindlichen Farbstoff hinzu und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang. Visualisieren Sie anschließend die Zellen auf einer temperaturkontrollierten Probebühne eines konfokalen Abbildungssystems. Alternativ, um mitochondriale ROS in TLR-aktivierten Zellen sichtbar zu machen, geben Sie den mitochondrialen Superoxid-Indikator hinzu und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Verwenden Sie als Negativkontrolle entweder PBS oder DMSO als Positivkontrolle. Behandeln Sie die Zellen mit zwei Millimolar Antimycin. Fahren Sie fort, um alle Zellen auf der temperaturgesteuerten Probebühne eines konfokalen Abbildungssystems zu visualisieren.

Analysieren Sie alle Bilddaten mithilfe der Image-J-Software. Der fluoreszierende Sensor erkennt Hyperperoxid in submikromolaren Konzentrationen spezifisch, und basierend auf dem Säugetier-Expressionsvektordesign kann dieser gezielt auf das Zytoplasma oder die Mitochondrien ausgerichtet werden. Erstellen Sie mittels Elektroporation stabile Zelllinien aus murinen pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen, die ein inappropriates Hyper-Expressionsplasmid tragen.

Um das Koloniewachstum zu fördern, platten Sie die Zellen in niedriger Dichte in vollständigem TMEM aus und inkubieren Sie sie 48 Stunden lang. Ersetzen Sie dann das Medium durch vollständiges Kulturmedium, das mit einem Selektionsantibiotikum ergänzt wurde. Untersuchen Sie die Klone hinsichtlich des höchsten Prozentsatzes an hyperpositiven Zellen und vergrößern Sie die Kultur, um stabile hyperpositive Linien in einzelnen Experimenten zu erzeugen. Säen Sie die Zellen auf mit 0,2 % Gelatine beschichteten Deckgläsern aus und kultivieren Sie sie über Nacht bis zu einer Konfluenz von 80 %.

Aktivieren Sie nun die Zellen mit TLR-Liganden und inkubieren Sie sie sechs Stunden bei 37 Grad Celsius. Zum Nachweis zytoplasmatischer ROS montieren Sie die Deckgläser mit Zellen in eine Adelo-Zellkammer. Geben Sie ein Milliliter vorgewärmte Tanks, Puffer-Salzlösung hinzu und stellen Sie die Kammer auf eine temperaturgesteuerte Stufe des konfokalen Abbildungssystems.

Fluoreszenzänderungen in Zellen zur Detektion von mitochondrialen ROS aufzeichnen. Führen Sie eine positive Kontrolle mit zwei Mikromolar Antimycin A durch. Bereiten Sie anschließend die Deckgläser der behandelten Zellen für die konfokale Mikroskopie vor. Führen Sie die Bildanalyse mit der Image-J-Software durch.

Beginnen Sie mit endothelialen Zellen, die auf mit Gelatine beschichteten Objektträgern bis zu einer 80 %igen Konfluenz kultiviert wurden, um intrazelluläre Kalziumänderungen sichtbar zu machen und zu messen. Inkubieren Sie die Zellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff Fluo-4 AM bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um den Farbstoffverlust zu minimieren. Waschen Sie die Zellen anschließend mit der experimentellen Bildgebungslösung, die Saponin enthält. Bringen Sie die Objektträger nun in einer Adhäsionskammer mit 800 µL vorgewärmter experimenteller Bildgebungslösung an und positionieren Sie die Zellen auf einer temperaturgeregelten Probe des konfokalen Bildgebungssystems in einem separaten Gefäß.

Verwenden Sie 500 Nanogramm pro Milliliter Cell Tracker Red C-M-T-P-X für 15 Minuten, um die zu untersuchende Makrophagenpopulation zu markieren; waschen Sie die Zellen und resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern experimenteller Bildgebungslösung. Geben Sie nun die markierten Makrophagen auf die mit Fluoh 4:00 AM beladenen endothelialen Zellen in der Konfokal-Kammeranordnung und nehmen Sie alle drei Sekunden über einen Zeitraum von 10 Minuten die grüne und rote Fluoreszenz auf.

In diesem Experiment wurden J 7 74 0.1-Zellen sechs Stunden lang mit TLR zwei, drei und vier-Liganden stimuliert. Repräsentative konfokale Aufnahmen zeigen einen erhöhten zytosolischen R os, gemessen mittels DCF. Interessanterweise weist die MitoSOX-Rot-Fluoreszenz auf eine ähnliche Zunahme an mitochondrialen ROS hin.

Diese Fluoreszenzänderungen sind quantitativ. Daher müssen die Ergebnisse normalisiert und als relativer Faltungswechsel pro Behandlung ausgedrückt werden; das Antimycin A-Signal bestätigt eine positive Kontrolle für die mitochondriale ROS-Produktion. Diese Abbildung zeigt Bilder der Peroxidkonzentrationen in Endothelzellen, im Zytoplasma und in Mitochondrien in stabil exprimierenden Hyper-Cyto- oder Hyper-Mito-D-Zellen.

MP-Zellen im ECS, die mit TLR-Agonisten stimuliert wurden. Die Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzänderung zeigt eine Zunahme der Hyper-Cyto- und Hyper-D-Mito-Fluoreszenz nach sechs Stunden Stimulation in einem Kokultursystem. Um die Peregrine-ROS-Signalgebung zu bewerten, wurden frisch isolierte Mirin-Makrophagen sowohl aus Wildtyp- als auch aus GP-91-phox-Knockout-Mäusen durch eine Stimulation mit einem Mikrogramm pro Milliliter LPS über sechs Stunden aktiviert.

Makrophagen wurden mit C-M-T-P-X rot markiert und zu grün fluoreszierenden Vier-Last-MPM-ECS hinzugefügt. Interessanterweise lösten durch LPS aktivierte Makrophagen, die aus Wildtyp-Mäusen isoliert wurden, im Vergleich zu Makrophagen aus GP 91 Fox Null-Mäusen eine starke und schnelle Kalziummobilisierung in den MPM-ECS aus.

Während LI versucht, dieses Verfahren durchzuführen, ist es wichtig, daran zu denken, dass sowohl eine verlängerte Inkubation als auch Laserexposition zur Autooxidation von DCF führen können. Es ist entscheidend, eine Photobleiche von hyper cyto und hyper D mitral zu vermeiden. Sobald die RA-Messung beherrscht ist, kann sie in Makrophagen sowie in endothelialen Zellen innerhalb von sieben Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.