Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Einfluss mechanischer Belastung auf die proteolytische Spaltung einzelner Proteine auf hochparallelisierte und kosteneffiziente Weise zu untersuchen. In dieser Demonstration wird im ersten Schritt die Spaltung von Kollagen durch Matrix-Metalloproteinasen-1 untersucht: Kollagentrimer werden an die Glasdeckenscheibe einer Durchflusszelle gebunden, gefolgt von der Anheftung von mikrometergroßen magnetischen Kügelchen an die einzelnen Kollagenmoleküle. Im zweiten Schritt wird die Durchflusszelle in die Magnet-Optoden-Apparatur eingesetzt und überprüft, ob unspezifisch gebundene Kügelchen von der Oberfläche der Deckenscheibe entfernt wurden.

Anschließend wird die Protease zu den Flusszellen hinzugegeben. Im letzten Schritt wird die Proteolysegeschwindigkeit durch die Echtzeitüberwachung der Ablösung der Kügelchen bestimmt. Durch die Messung der Ablöseraten der Kügelchen bei variierenden Proteasekonzentrationen und Kräften lassen sich unter Verwendung geringster Mengen an Substrat und Protease standardmäßige kinetische Parameter der Enzymkinetik ableiten.

Außerdem liefert diese Technik einzigartige Informationen über den Einfluss mechanischer Kräfte auf die Proteolyserate sowie über die strukturellen Veränderungen im Substratprotein, die mit dem Spaltungsvorgang einhergehen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Methoden wie optischen T-Spuren und Rasterkraftmikroskopie besteht darin, dass sie hochdurchsatzfähig und kosteneffizient ist. Obwohl diese Methode Einblicke in die wirksame Kraft bei der proteolytischen Spaltung einzelner Proteine ermöglicht, können die verwendeten Geräte und Techniken auf ein breites Spektrum biophysikalischer Fragestellungen angewendet werden, einschließlich des Einflusses mechanischer Kräfte auf die Proteinfaltung und Konformation.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Flusszelle, indem Sie Deckgläser durch Beschallung reinigen. Geben Sie die Deckgläser in einen kleinen Glasbehälter, der sie aufnehmen kann und in den Ultraschallbadbehälter passt. Füllen Sie den Behälter mit Isopropanol und behandeln Sie ihn 20 Minuten im Ultraschallbad, anschließend entfernen Sie das Isopropanol und spülen die Deckgläser mit reichlich entionisiertem Wasser ab.

Füllen Sie den Behälter mit Wasser und behandeln Sie ihn 20 Minuten lang mit Ultraschall. Trocknen Sie die Deckgläser nach der Beschallung in einem Strom gefilterter, staubfreier Luft. Prüfen Sie die Deckgläser und verwenden Sie nur diejenigen, die frei von Verschmierungen sind.

Erhitzen Sie die Deckgläser vorsichtig einige Sekunden lang, um verblebenden Staub und Feuchtigkeit zu entfernen, indem Sie die Deckgläser durch eine Gasflamme eines Bunsenbrenners führen. Achten Sie dabei darauf, dass die Deckgläser durch übermäßige Hitze nicht verformt werden. Dieser Schritt entfernt restliche Oberflächenkontaminationen.

Als Nächstes verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um die beiden Deckgläser miteinander zu verbinden. Schneiden Sie zunächst ein etwa drei Zentimeter langes und 0,3 Zentimeter breites Stück Klebeband zu und befestigen Sie es an einem 22 mal 40 Millimeter großen Deckglas, sodass ein 1,6 Zentimeter breiter Kanal in der Mitte verbleibt. Drücken Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf das Deckglas, um sicherzustellen, dass das Klebeband ordnungsgemäß haftet.

Die Magnetpinzette wurde in diesem Labor mithilfe einer Aluminium-L-Form mit einer ein Millimeter durchmessenden Pinhole hergestellt und auf einem vertikalen Z-Translator montiert, um die Höhe der Pinzette zu regulieren. Zwei permanente Seltenerd-Magnete wurden beidseits der Pinhole am Halter befestigt, um den magnetischen Feldgradienten zu erzeugen. Eine korrekte Kalibrierung der magnetischen Falle ist für dieses Verfahren unerlässlich.

Um den Erfolg sicherzustellen, verwenden wir zwei verschiedene Methoden, wie in diesem Abschnitt beschrieben. Zur Kalibrierung der magnetischen Falle verwenden Sie zuvor präparierte DNA aus dem Lambda-Phagen, die an ihren 5'- und 3'-Enden mit Biotin und Doxygen markiert ist, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Um die DNA an die Durchflusszelle zu binden, füllen Sie zunächst die Durchflusszelle mit Anti-Doxygen-Antikörperlösung und lassen den Antikörper 15 Minuten lang an der Glasoberfläche haften.

Anschließend wurde die Oberfläche der Durchflusszelle passiviert, um unspezifisches Anhaften von DNA zu verhindern, indem eine BSA-Lösung in die Durchflusszelle gegeben wurde. Beachten Sie, dass für diesen Passivierungsschritt und alle nachfolgenden Schritte das hinzugegebene Reagenzvolumen mindestens zweifach im Vergleich zum Volumen der Durchflusszelle sein sollte. Das Volumen der Durchflusszelle beträgt in dieser Demonstration 75 µL; inkubieren Sie die Durchflusszelle bei Raumtemperatur für 45 Minuten.

Nachdem dieser Schritt wiederholt wurde, 50 Pikomolar funktionalisiertes Lambda-DNA zugeben und 15 Minuten lang an die Deckglasoberfläche binden lassen, überschüssiges DNA mit einem Mal XPBS abwaschen. Abschließend streptavidinbeschichtete superparamagnetische Kügelchen hinzufügen und 15 Minuten lang an die immobilisierte DNA binden lassen. In diesem Demonstrationsversuch werden 2,8-Mikrometer-Kügelchen verwendet.

Spülen Sie überschüssige Kügelchen mit einem XPBS ab. Führen Sie anschließend die Kalibrierung der magnetischen Pinzette durch, indem Sie die Permanentmagnete an eine Position bewegen, die weit entfernt von der Probenoberfläche ist. Danach platzieren Sie die vorbereitete Durchflusszelle im Mikroskop.

Bringen Sie die Permanentmagnete in Position über der Durchflusszelle. Wählen Sie die Fokusebene der mit Lambda-DNA funktionalisierten Kügelchen, indem Sie auf die Kügelchen fokussieren, die sich von beiden Glasoberflächen entfernt befinden. Die korrekte Fokusebene ist die, in der die gewünschten Kügelchen ein helles Zentrum aufweisen.

Nehmen Sie ein Video der Bewegung der Perlen auf, das höher als 80 Hertz für 500 Bilder ist. Bewegen Sie den Magneten näher an die Probenoberfläche und nehmen Sie jeweils ein Video der Perlenbewegung an jeder Position auf. Für Abstände jenseits von fünf Millimetern bewegen Sie sich in Ein-Millimeter-Schritten; für Abstände zwischen einem und fünf Millimetern ebenfalls in Ein-Millimeter-Schritten.

Bewegen Sie sich in 0,5 Millimeter-Schritten für Distanzen unter einem Millimeter, bewegen Sie sich in 0,25 Millimeter-Schritten. Verfolgen Sie für jeden Datensatz das Zentrum der Kügelchen mithilfe einer 2D-Gauß-Anpassung. Berechnen Sie die Kraft über Brown’sche Fluktuationen, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben. Überprüfen Sie die Genauigkeit der Kräfte, indem Sie die Kraftberechnung über eine Lian-Anpassung des Leistungsspektrums prüfen.

Um die Abrollfrequenz zu bestimmen, kann der Zusammenhang zwischen der angelegten Kraft und der Abrollfrequenz im Text vor der Anlagerung des Kollagenpeptids an die Durchflusszellen ermittelt werden, anschließend das Kollagenpeptid sowie das MMP-1-Protein exprimieren und reinigen. Beginnen Sie damit, die Anti-Myc-Antikörper-Lösung der Durchflusszelle hinzuzufügen und 20 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren, um die Bindung der Anti-Myc-Antikörper an die Oberfläche der Durchflusszelle zu ermöglichen. Blockieren Sie die Durchflusszelle, um unspezifische Proteinbindung zu verhindern, mit 5 Milligramm pro Milliliter BSA. Geben Sie 150 Pikomolar Kollagenpeptid hinzu und lassen Sie es 45 Minuten lang über den Myc-Tag an den Antikörper binden.

Spülen Sie überschüssiges Kollagen mit PBS-Puffer weg, bevor Sie 2,8-Mikrometer-Kügelchen der Durchflusszelle hinzufügen. Diese sollten mithilfe starker Magnete von der Strep-Divid- und der beschichteten Kügelchenlösung getrennt und anschließend in PBS resuspendiert werden. Dieser Vorgang sollte dreimal wiederholt werden.

Dieser Schritt ist entscheidend, damit die 2,8-Mikrometer-Kügelchen an die immobilisierte Kollagenpeptidoberfläche binden. Danach Streptavidin-beschichtete superparamagnetische Kügelchen hinzufügen und 45 Minuten lang an die Kollagenmoleküle andocken lassen. Sobald die Durchflusszelle mit Kollagenpeptid und magnetischen Kügelchen bestückt ist, die Zelle im magnetischen Fallen-Setup abbilden.

Unter geringer Kraft wirkt eine Teilpopulation der Kügelchen manchmal schwach und haftet unspezifisch an der Oberfläche. Die Anwendung einer mäßigen Kraft stellt sicher, dass diese Kügelchen gelöst werden. Geben Sie das aktivierte Enzym in die Durchflusszelle.

In diesem Fall wurde MMP-1 durch Zugabe von 3,5 Millimolar A PMA voraktiviert und bei 37 Grad Celsius für drei Stunden inkubiert. Sobald eine Flusszelle wieder in die Magnet-Force-Messapparatur eingeführt wird, zeichnen Sie ein Video auf, das mehrere Sichtfelder umfasst, wodurch typischerweise mehrere hundert angeheftete Perlen erhalten werden. Diese Messung entspricht der Zeit gleich null.

Wiederholen Sie denselben Vorgang der Aufnahme mehrerer Blickfelder zu regelmäßigen Zeitpunkten, bis alle Kügelchen abgelöst sind oder keine weitere Proteolyse erkennbar ist. Magnetische Pinzetten wurden für Kügelchen mit einem Mikrometer und 2,8 Mikrometern kalibriert. Unter Verwendung sowohl der Größe der beobachteten brownschen Fluktuationen als auch der Berechnung der Roll-off-Frequenz bei variierenden Magnetpositionen in den Experimenten zur erzwungenen Proteolyse kann die normalisierte Anzahl verbleibender Kügelchen als Funktion der Zeit aufgetragen werden, um die Proteolyserate zu bestimmen.

Und dieser Prozess kann für unterschiedliche Enzymkonzentrationen und Kräfte wiederholt werden. Die Proteolyseraten hängen von der aufgebrachten Kraft ab. Die Raten der Proteolyse wurden bei einem Pico-Newton, 6,2 Pico-Newton und 13 Pico-Newton bestimmt.

Der Anteil der unpro behafteten Perlen liegt bei mehr als 15 Minuten und bleibt über verschiedene Experimente hinweg mit etwa 0,25 annähernd konstant. In unserem Fall ermöglichte uns der Assay, die katalytische Effizienz von MMP1 als Funktion der aufgebrachten Kraft zu messen. Durch die Analyse der Daten fanden wir heraus, dass die Kollagentripelhelix lokal entwunden sein muss, bevor eine Proteolyse stattfinden kann.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in fünf bis sechs Stunden durchgeführt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass mindestens 30 bis 50 Kügelchen pro Bildfeld erforderlich sind, um eine gute statistische Signifikanz Ihrer Daten zu erzielen. Vergessen Sie nicht, dass PMA äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Laborkittel und Atemschutzmaske stets getragen werden sollten, während dieses Experiment durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Einfluss von Kraft auf die proteolytische Spaltung einzelner Proteine mithilfe magnetischer Pinzetten messen kann. Die magnetischen Pinzetten sind ein hervorragendes Werkzeug, um Einzelmolekül-biophysikalische Experimente zu verstehen. Diese Technik kann auf andere Protease-Substrat-Kombinationen erweitert werden.

Außerdem können ähnliche Techniken verwendet werden, um die strukturelle Dynamik von Proteinen sowie andere Proteine, die RNA und/oder DNA binden oder modifizieren, zu untersuchen.