Stretching kurze DNA-Sequenzen mit Constant Force Axial Optische Pinzetten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, kurze DNA-Moleküle mit einer Länge von 100 Nanometern mithilfe konstanter, gut kalibrierter optischer Kräfte zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem die DNA an einem Ende an einen Deckglaser und am anderen Ende an eine Polystyrol-Mikrokugel befestigt wird. Anschließend werden die optischen Fallen justiert und kalibriert.

Anschließend wird die DNA durch eine Kombination aus Gradientenkräften und Streukräften, die auf die Mikrokugel wirken, von der Oberfläche weggestreckt. Schließlich wird die DNA verlängert, indem die Kugel im linearen Bereich des Potentials fixiert wird. Das Protokoll wurde verwendet, um die mechanischen Eigenschaften von DNA sowie die Kinetik der DNA-Protein-Bindung zu untersuchen, und hat darüber hinaus zur Klärung der Bedeutung von Randbedingungen für die Elastizität kurzer DNA-Konstrukte beigetragen.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Ausrichtung und Kalibrierung der optischen Fallen mit konstanter Kraft kompliziert und anspruchsvoll ist. Die optischen Fallen bestehen aus einem Strahl eines 1064 Nanometer-Lasers, der in zwei orthogonal polarisierte Strahlen aufgeteilt wird. Einer wird zur Manipulation des Biomoleküls verwendet, der andere dient Kalibrierungszwecken.

Die Intensität des Manipulationsstrahls wird durch einen akusto-optischen Ablenker oder einen OD gesteuert. Die Strahlen werden anschließend mit einem weiteren polarisierenden Strahlteiler wieder zusammengeführt. Die Strahlen werden durch ein Plan-APO-60×-1,4-Ölimmersions-Objektiv eng auf die Probeleite fokussiert. Dieser Tweezer-Aufbau ist mit einem selbstgebauten Hellfeldmikroskop kombiniert, das Beleuchtung von einer Halogenlampe bereitstellt, die durch einen Kondensor auf die Probenkammer fokussiert wird.

Das Hellfeldbild wird durch einen dichroitischen Spiegel vom Laserlicht getrennt und anschließend auf zwei CCD-Kameras abgebildet. Eine CCD-Kamera dient als primäre Methode zur Datenaufnahme und wird softwaregesteuert ausgelöst, um präzise Abtastraten zu erzielen. Die andere CCD-Kamera wird verwendet, um ein einzelnes festgeklebtes Referenzmikrosphäre abzubilden, deren Position als Rückkopplungsregelung dient, um Drift im Mikroskop auszugleichen.

Die Probe wird grob bezüglich des Objektivs mittels eines XY-Stages positioniert und anschließend präzise mittels eines eingebauten dreidimensionalen Piso-Stages justiert. Das vorwärts gestreute und transmittierte Laserlicht wird durch den Hellfeldkondensor gesammelt und auf einen Photodetektor fokussiert, um die Größe der Perle zu kalibrieren. Beladen Sie eine Probenkammer mit einer dispergierten Lösung von 800 Nanometer durchmessenden Polystyrol-Mikrokügelchen, die in phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt sind. Lassen Sie die Lösung 10 bis 15 Minuten ruhen und spülen Sie danach vorsichtig mit Puffer.

Um überschüssige Mikrokügelchen zu entfernen, lokalisieren Sie ein zufällig am Deckglas haftendes Mikrokügelchen und justieren Sie die Höhe der Probenkammer, bis sich das Mikrokügelchen etwa einen Mikrometer unterhalb der Fokusebene befindet. Um ein defokussiertes Bild zur Bestimmung der scheinbaren Bildgröße mittels LabView zu erzeugen, bestimmen Sie zunächst das Zentrum des Mikrokügelchens mithilfe der geometrischen Mustervergleichsfunktion. Erzeugen Sie anschließend ein radiales Intensitätsprofil des Mikrokügelchens, indem Sie über 360 Grad mitteln.

Passen Sie an das Zentrum jedes Querschnitts das radiale Profil an, das einem weißen Ring in jedem der Hellfeldbilder entspricht, mithilfe einer quadratischen Funktion. Um ein Helligkeitsmaximum zu finden, kann der Abstand zwischen diesem Maximum und dem Zentrum als Maß für die scheinbare Größe der Perle verwendet werden, wobei der kalibrierte Piso-Tisch schrittweise in axiale Richtung verstellt wird. Erhöhen Sie die axiale Position der Mikrokugel schrittweise und nehmen Sie mit der CCD-Kamera jeweils ein Bild an jeder axialen Position auf. Wiederholen Sie die Bildanalyse für jedes aufeinanderfolgende Bild, um die scheinbare Größe der Mikrokugel mit ihrer axialen Position zu korrelieren.

Die axiale Auflösung, die mit dieser Methode erzielt wird, beträgt etwa 1,4 Nanometer, um das optische Potential des Manipulationsstrahls abzubilden. Beginnen Sie damit, den Manipulationsstrahl und den Kalibrierstrahl kollinear auszurichten, wobei der Manipulationsstrahl ausgeschaltet ist. Halten Sie eine freie Mikrokugel im wesentlich steiferen Fang des Kalibrierstrahls fest. Schalten Sie nun den Manipulationsstrahl ein.

Da der Kalibrierstrahl deutlich stärker ist als der Messstrahl, wird die axiale Position der Mikrokugel leicht gestört. Die sich daraus ergebende Änderung der axialen Position kann aus den defokussierten Hellfeldaufnahmen gemäß der bereits beschriebenen Methode gemessen werden. Verlagern Sie den axialen Fokus und tragen Sie anschließend die Verschiebung Delta X gegen die axiale Position des Fokus des Kalibrierstrahls auf.

Die axiale Position, die der größten Auslenkung der Mikrokugel entspricht, bestimmt das Zentrum des linearen Bereichs der optischen Falle. Um eine DNA-Probe zu dehnen, montieren Sie die Kammer mit an der Oberfläche verankerten DNA-Molekülen und platzieren Sie unter Beobachtung des Hellfeldbildes den Fokus des Manipulationsstrahls durch Justieren des Teleskops leicht oberhalb der ungedehnten Mikrokugeln. Anschließend justieren Sie die Position des Stages, bis eine der Mikrokugeln eingefangen ist. Positionieren Sie die Mikrokugel grob in der Mitte der XY-Ebene der optischen Falle, erzeugen Sie eine Serie von Rechteckwellen in LabView und senden Sie diese an die AOD, um den Laserstrahl wiederholt ein- und auszuschalten.

Beobachten Sie die Mikrokugel, während die Falle wiederholt ein- und ausgeschaltet wird. Achten Sie darauf, ob der Laser eine bevorzugte Bewegungsrichtung der Mikrokugel verursacht, während Sie die Position der Mikrokugel iterativ in X- und Y-Richtung justieren. Durch die Steuerung des PISO-Stage sollte die zufällige Bewegung der Mikrokugel in der X-Y-Ebene isotrop werden, obwohl sie merklich eingeschränkt ist, wenn der Laser eingeschaltet ist.

Als Nächstes richten Sie die Perle in Z-Richtung aus. Pulsieren Sie erneut den Laserstrahl ein- und ausgeschaltet, während Sie diesmal gleichzeitig die axiale Verschiebung der Mikrokügelchen in Echtzeit messen.

Zentrieren Sie den Tisch im linearen Bereich, also dem Punkt, an dem die Z-Verschiebung am größten ist, um die DNA-Rampe zu dehnen, indem Sie die Laserintensität übermitteln, indem Sie ein Spannungssignal an die A OD von null Volt auf 0,5 Volt in Schritten von 0,025 Volt in jedem Schritt senden. Nehmen Sie 400 Bilder mit 100 Bildern pro Sekunde auf und mitteln Sie diese, um die axiale Verschiebung zu erhalten. Zeichnen Sie abschließend die Kraft-Dehnungs-Kurven auf und passen Sie sie an ein modifiziertes Worm-like-Chain-Modell an.

Hier gezeigte Kraft-Dehnungs-Kurven für 2D-NA-Sequenzen mit Längen von 1, 298 Basenpaaren und 247 Basenpaaren für kurze DNA-Abschnitte. Das herkömmliche Wurm-artige-Kette-Modell (WLC-Modell) erklärt den Zusammenhang zwischen Kraft und Dehnung nicht vollständig, da auf diesen Längenskalen endliche Größeneffekte sowie die Dehnung bei Nullkraft, die sich aus Randbedingungen ergibt, berücksichtigt werden müssen. Die Kraft-Dehnungs-Messungen müssen daher mithilfe eines modifizierten WLC-Modells angepasst werden, das eine effektive Persistenzlänge und die Dehnung bei Nullkraft als Anpassungsparameter enthält, wie in den ergänzenden Materialien näher beschrieben.

Für große Konturlängen von D-S-D-N-A ist die effektive Steifigkeitslänge einfach die nominelle Steifigkeitslänge von etwa 50 Nanometern, und die Dehnung ohne Krafteinwirkung kann bei den modifizierten WLC-Anpassungen vernachlässigt werden. Die effektiven Steifigkeitslängen betragen 35 Nanometer für die 1.298 Basenpaare lange DNA und 25 Nanometer für die 247 Basenpaare lange DNA nach ihrer Entwicklung. Diese Methode ebnete den Weg für eine Vielzahl von nanomechanischen Messungen an DNA und DNA-Protein-Komplexen, einschließlich einer Untersuchung der Kinetik der Bildung und Auflösung regulatorischer proteinvermittelter DNA-Schleifen.