Live-Cell-Imaging von wandernden Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-markierten Proteinen in einer dreidimensionalen Matrix

Dieses Experiment zielt darauf ab, fluoreszenzmarkierte Proteine in lebenden Zellen in einer 3D-Matrix abzubilden. Erzeugen Sie zunächst stabile Zelllinien, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren. Säen Sie diese Zellen in eine 3D-Kollagenmatrix aus und nehmen Sie anschließend Zeitrafferaufnahmen von wandernden Zellen mit einem konfokalen Mikroskop auf.

Letztlich beleuchten die Ergebnisse die Proteinlokalisation und -dynamik in wandernden Zellen mittels Zeitrafferaufnahmen und FP-Analyse, wobei die Proteindynamik und -lokalisation in 3D und in Echtzeit beobachtet wird. Bietet einen Ansatz zur Beantwortung grundlegender Fragen zur Zellmigration. Zum Beispiel: Wie werden adhesive Kontakte durch zytoplasmatische Proteine reguliert?

Und außerdem, wie werden diese Kontakte durch spezifische Inhibitoren gestört? In einer P 35 -Kulturschale kultivieren Sie Zellen bei 80 bis 90 % Konfluenz und transfizieren Sie die Zellen mit dem gewünschten Plasmid unter Verwendung von Lipo 2000 gemäß den Herstelleranweisungen. Anschließend stellen Sie die Zellen in einen Inkubator.

Am nächsten Tag die Zellen auf zwei P150-Petrischalen aufteilen und über Nacht inkubieren. Das Medium ergänzen, indem 50 Mikrogramm pro Milliliter G418 hinzugefügt werden. Die Kultur zwei Wochen lang unter Antibiotikaselektion weiterführen.

Untersuchen Sie die Kultur auf G vier 18-resistente Kolonien. Anschließend identifizieren und markieren Sie mithilfe eines invertierten Fluoreszenzmikroskops GFP-positive Kolonien.

Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Lassen Sie nach dem zweiten Waschschritt eine dünne Flüssigkeitsschicht zurück, um zu verhindern, dass die Zellen jeder markierten Kolonie austrocknen. Wischen Sie mit einem sterilisierten Wattestäbchen so nah wie möglich am Rand entlang und pipettieren Sie 10 Mikroliter Trypsin auf die Kolonie.

Wiederholen Sie dies schnell für jede Kolonie. Inkubieren Sie dann die Platte bei 37 Grad Celsius zur Zellablösung. Überprüfen Sie das runde Erscheinungsbild unter dem Mikroskop.

Geben Sie 10 Mikroliter Trypsin auf jede Kolonie und pipettieren Sie, um die Zellen vollständig von der Platte zu lösen. Überführen Sie anschließend jede Zellkolonie in eine einzelne Vertiefung einer 24-Loch-Kulturschale, um stabile Kolonien zu amplifizieren. Bewerten Sie danach die Proteinausprägung der Kolonien mittels Standard-Western-Blot und Immunfluoreszenz.

Erweitern Sie die Oberflächenmodifikation des Glases für ausgewählte Zelllinien. Der Boden der Schale ermöglicht eine optimale Kollagenbindung. Pipettieren Sie 300 Mikroliter Silanisierungslösung auf den Glasbereich jeder P-35-Schale mit einem 10-Millimeter-Öffnungsdurchmesser.

Einmal eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Die Lösung abziehen und dreimal je zehn Minuten mit filtriertem Wasser waschen. Das Wasser entfernen und die Schalen 1,5 Stunden lang auf eine Heizplatte mit 50 Grad Celsius stellen.

Stellen Sie die Deckel der Schalen leicht versetzt auf, um das Trocknen zu ermöglichen. Nachdem die trockenen Schalen abgekühlt sind, pipettieren Sie 300 Mikroliter einer 2 %igen Glutaraldehydlösung auf den Glasabschnitt jeder Schale. Inkubieren Sie eine Stunde lang und waschen Sie anschließend dreimal mit PBS, jeweils zehn Minuten lang.

Sterilisieren Sie die Schalen anschließend durch Bestrahlung mit UV-Licht für eine Stunde. Zentrifugieren Sie zunächst 100 Mikroliter fluoreszierende Tracerteilchen, um ein Pellet zu erhalten. Entsorgen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren Sie die Teilchen in 500 Mikrolitern Medium.

Führen Sie fünf Waschschritte durch und resuspendieren Sie die Partikel anschließend in 30 Mikrolitern Medium. Danach gewinnen Sie die GFP-exprimierenden Zellen mittels Trypsin und bereiten eine Suspension von 2 Millionen Zellen pro Milliliter in einem Eppendorf-Röhrchen vor. Pipettieren Sie 240 Mikroliter Wachstumsmedium. Geben Sie 12,6 Mikroliter einer einmolaren HEPES-Lösung, 20 Mikroliter filtriertes Wasser, 50 Mikroliter der Zellsuspension und 10 Mikroliter der fluoreszierenden Partikel hinzu.

Als Letztes 167 Mikroliter bovines Dermiskollagen hinzufügen und die Lösung gründlich mischen. Anschließend 80 Mikroliter auf den Glasabschnitt der vorbereiteten silanisierten Schale überführen. Die Probe 50 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, damit das Gel polymerisieren kann.

Fügen Sie dann vorsichtig zwei Milliliter Wachstumsmedium hinzu. Puffern Sie die Mikroskopkammer auf eine konstante Temperatur von 37 Grad Celsius und ergänzen Sie das Zellmedium. Um einen neutralen pH-Wert für die DIC-Bildgebung aufrechtzuerhalten, tauschen Sie die Oberseite der Schale gegen eine Glasoberseite mit einem dünnen Streifen Paraformaldehyd aus.

Bedecken Sie die Seite der Petrischale, um Verdunstung bei Verwendung eines Öl-Immersion-Objektivs zu verhindern. Geben Sie einen Tropfen Immersionsflüssigkeit auf die Position des Objektivs. Stellen Sie das Kollagengel mit der Petrischale auf den Mikroskoptisch, sodass die Schale mit der Immersionsflüssigkeit in Kontakt kommt.

Fokussieren Sie die Probe und suchen Sie die Zellen von Interesse zur Abbildung, um Drift der Objektbühne zu minimieren. Lassen Sie die Petrischale etwa 45 Minuten lang ruhen. Legen Sie vor Beginn einer langen Aufnahme die Parameter der Bildaufnahme für Experimente mit Inhibitorgabe fest.

Bereiten Sie ergänztes Medium mit dem Wirkstoff in der gewünschten Arbeitskonzentration vor. Ersetzen Sie das Zellmedium, um einen neutralen pH-Wert aufrechtzuerhalten, versiegeln Sie jedoch nicht mit Perfil. Überführen Sie die Probe in das Mikroskop und beginnen Sie unmittelbar mit der Bildaufnahme zum Zeitpunkt der Wirkstoffbehandlung.

Halten Sie das Bild an, nehmen Sie die Schalenabdeckung ab und entfernen Sie sie vorsichtig, ohne die Schale zu stören. Aspirieren Sie das Medium und pipettieren Sie das Medikament enthaltende Medium in die Schale. Setzen Sie dann die Schalenabdeckung vorsichtig wieder auf.

Die Top-Frap-Einstellung variiert zwischen Systemen. Konsultieren Sie daher die Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie zunächst die Parameter für die Live-Cell-Bildgebung ein.

Zum Photobleichen: Testen Sie diese Parameter an Übungszellen, um eine ausreichende Laserleistung zu erzielen, mit der das fluoreszierende Signal photobleicht werden kann, ohne die Zelle zu schädigen. Beginnen Sie anschließend mit der Bildaufnahme am Probensystem, wobei mindestens fünf Einzelbilder aufgenommen werden.

Danach den Bereich von Interesse photobleichen. Setzen Sie die Aufnahme über die Erholungszeit fort. Messen Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität des photobleichten Bereichs vor und nach der Photobleiche über die Zeit hinweg unter Verwendung einer Software zur statistischen Analyse.

Passen Sie die Erholungskurve an die exponentielle Gleichung an. Ermitteln Sie die Parameter für die Halbwertszeit und die Endintensität aus der exponentiellen Anpassungskurve. Berechnen Sie anschließend den mobilen Anteil, indem Sie das Verhältnis der End- zur Anfangsfluoreszenzintensität bilden.

Diese 3D-Lebendzellbilder zeigen gesunde epitheliale Zellen, die GFP-Aktin exprimieren. Nach vier Tagen Kultur bildeten diese Zellen eine Zyste in einer 3D-Kollagenmatrix. Einige Zellen wanderten entlang der Oberfläche der Zyste, während andere innerhalb des Inneren der Zyste migrierten.

Die Matrixverformung infolge der Zugkräfte, die von wandernden Zellen ausgeübt werden, wird durch die Verschiebung von in der umgebenden Matrix eingebetteten Tracer-Partikeln analysiert. Hier wird der Effekt der Hemmung der RO-Kinase auf die Zugkraft gezeigt. Die Bewegungen der Tracer-Partikel werden als maximale Projektionsaufnahme verschiedener Zeitpunkte dargestellt, wobei jeder Zeitpunkt mit einer Pseudofärbung versehen ist.

Alternativ werden die Bilder eines einzelnen Tracerteilchens als Montage dargestellt, um die Bewegung des Tracerteilchens zu zeigen. Im Zeitverlauf bewegte sich dieses Tracerteilchen vor und nach der Zugabe von Y 2 7 6 3 2 jeweils auf den hinteren Zellrand der wandernden Zelle zu und wieder von ihm weg. Die FRAP-Analyse verfolgt Zellen, die GFP-Aktin exprimieren, während sie in einer dreidimensionalen Matrix wandern, und zeigt eine typische Fluoreszenz-Wiederherstellung. Nach einem Photobleich-Experiment bei optimierten Laserbedingungen ist die Fluoreszenzintensität des interessierenden Bereichs im Vergleich zum Hintergrundniveau sichtbar verringert, während gleichzeitig gesunde und unbeschädigte Zellen erhalten bleiben.

Dieses Diagramm zeigt die Anpassung der Wiederfindungskurve an eine exponentielle Funktion. Sobald der Vorgang beherrscht ist, kann das Aussäen der Zellen in die Matrix eine Stunde dauern. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit drei Amino-Propyl-Trimethyl äußerst gefährlich sein kann.

Treffen Sie daher Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in der chemischen Abzugshaube. Denken Sie außerdem daran, sterile Bedingungen einzuhalten, wenn Sie mit Zellen in einer 3D-Matrix arbeiten.