Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

In diesem Verfahren zeigen wir einen quantitativen Ansatz der intravitalen Mikroskopie, um die Dynamik des Parasitentransits durch die Milz zu untersuchen. In einem Nagetier-Malaria-Modell werden mit GFP-transgenen Parasiten infizierte Mäuse für die intravitale Mikroskopie der Milz vorbereitet; die Kanülierung einer Milzvene ermöglicht die Injektion von intravitalen Farbstoffen. Während des Experiments werden fluoreszierende Zellen bei ihrer Bewegung in verschiedenen Bereichen der Milz abgebildet.

Wir liefern die Mythologie, um die Parasitenmobilität im dreidimensionalen langsamen Kompartiment des roten Pulps zu beschreiben, und berechnen den Blutfluss in den Gefäßen. Diese Parameter wurden verwendet, um die Milzdynamik zweier PULE-Stämme zu vergleichen. Hallo zusammen.

Mein Name ist Nando El Portillo und eine der zentralen Forschungsfragen in meinem Labor besteht darin, die Rolle der Milz bei Malaria zu verstehen. Die Splenomegalie ist eines der charakteristischen Merkmale dieser Krankheit, doch aufgrund technischer und ethischer Probleme ist es sehr schwierig, Studien an diesem Organ durchzuführen. Um dies zu ermöglichen, haben wir Technologien entwickelt, die es uns erlauben, den dynamischen Durchgang dieses Parasiten zu beobachten und dieses Phänomen zu quantifizieren.

Das ist es, was Lorena und MI in diesen Protokollen erklären werden. Diese Forschung wird teilweise in Zusammenarbeit mit den Gruppen von Dr. Ler von der Universität Hamburg in Deutschland und Dr. Maria Kbo hier im Krankenhaus Clinic durchgeführt und wurde allgemein von der Stiftung Cellex sowie dem ministeriellen CIA finanziert. Die Infektion wird von einem Spender-M ausgelöst, der entweder mit tödlichen oder nicht-tödlichen GFP-Parasiten bei 10 % Parasitämie infiziert ist. Um die Parasiten zu überprüfen, entnehmen Sie einen kleinen Blutstropfen aus der Schwanzvene der Maus und verteilen ihn auf einem Mikroskoppräparat.

Verschieben Sie eine cholemetrische Färbung mit GIMs. Eine Lösung ermöglicht die Sichtbarmachung infizierter roter Blutkörperchen nach dem Trocknen. Fixieren Sie den Blutausstrich zwei Minuten lang mit Methanol, geben Sie eine GIMs-Lösung auf und inkubieren Sie 20 Minuten lang. Spülen Sie den Objektträger mit fließendem Leitungswasser ab und trocknen Sie ihn. Ermitteln Sie den Prozentsatz der pbcs bezogen auf die Gesamtanzahl der Erythrozyten mithilfe eines Lichtmikroskops mit einer 100x-Ölimmersions-Objektivlinse.

Infizieren Sie Mäuse mit letalen oder nicht-letalen Parasiten, die aus dem Schwanzblut von Spendermäusen gewonnen und in PBS verdünnt wurden. Passen Sie die Dosis so an, dass eine halbe Million Parasiten pro Maus injiziert werden, um am dritten Tag nach der Infektion einen peripheren Parasitenbefall von 1 % zu erreichen, und führen Sie die Injektion intraperitoneal durch. Alternativ können FITC-markierte Erythrozyten als Kontrolle verwendet werden.

Tiere sammeln ein Milliliter arterielles Blut von einer Maus und waschen das Pellet durch Zentrifugation in PBS, das EDTA enthält, re span in FITC-Lösung und inkubieren zwei Stunden im Dunkeln unter leichtem Schütteln. Danach das Überstandvolumen durch Zentrifugation entfernen und ausgiebig waschen. In eine Kontrollmaus injizieren, um im peripheren Kreislauf einen Durchschnittswert von 1 % zu erreichen, und anschließend mit In-vivo-Experimenten fortfahren.

Hallo, ich bin Mija. Um die Milz in vivo abzubilden, müssen wir eine kleine Synergie des Tieres durchführen, um die Milz sichtbar zu machen. Diese Technik habe ich von Stephanie GR im Labor von Worker Heisler gelernt, der ich dafür danken möchte, und nun werde ich Ihnen zeigen, wie man vorgeht.

Bildgebung infizierter Myosen am dritten Tag nach der Infektion, wenn die Parasitämie bei beiden Stämmen 1 % beträgt. Die Maus während des gesamten Eingriffs narkotisiert und bei regulierter Temperatur halten. Die Augen vor Austrocknung schützen und sicherstellen, dass die Maus vollständig narkotisiert ist, indem man vor Fortfahren die Fußsohle reizt, um die intravenöse Verabreichung von Substanzen zu erleichtern.

Während des Experiments kannulieren Sie die Schwanzvene der Maus, um die Kanüle anzulegen. Stecken Sie eine kleine Nadel an einem Ende eines Schlauchs und dessen Applikator an das andere Ende. Füllen Sie die Kanüle mit physiologischer Kochsalzlösung, entfernen Sie Luftblasen und prüfen Sie, ob die Lösung korrekt durch die Kanüle fließt.

Die Seitenvene des Schwanzes wird sauber kaniert. Verbessern Sie die Sichtbarkeit, indem Sie am Schwanzansatz eine leichte Konstriktion vornehmen. Führen Sie die Spitze der Kanüle in die Vene ein.

Das Auftreten von Blut zeigt an, dass die Nadel korrekt positioniert ist. Andernfalls wiederholen Sie die Kanülierung weiter upstream in der Vene und befestigen Sie die Kanüle mit Kleber und Tape am Schwanz. Legen Sie den unteren Teil der Milz frei, indem Sie einen kleinen Schnitt in die Haut und Muskulatur an der linken dorsalen Seite des Tieres machen.

Platzieren Sie eine Milz dort, wo weniger Atembewegung beobachtet wird, und geben Sie PBS auf die freigelegte Oberfläche, um sie frei von Maishaaren und hydratisiert zu halten. Versiegeln Sie die Milz mit einem Deckgläschen, um die Visualisierung zu ermöglichen. Hallo, mein Name ist Lorena.

Das gezeigte Protokoll ermöglicht es uns, die Wanderung von PULI-Parasiten durch die Milz zu visualisieren. Dies war dank GFP-transgener Parasiten möglich. Gespendet freundlicherweise von James Burnes von der Drexel University.

Die Abbildung der Bewegung fluoreszierender Parasiten ermöglicht es uns herauszufinden, ob Verhaltensunterschiede zwischen tödlichen und nicht-tödlichen Stämmen bestehen. Die Videomikroskopie-Experimente wurden an einem Leica-Multiphotonenmikroskop durchgeführt, das mit einem Inkubationssystem mit Temperaturregelung und einem 63x-Glycerin-Objektiv ausgestattet war. Platzieren Sie das Tier auf dem Mikroskoptisch, wobei die abgedeckte Milz nach unten zum Objektiv zeigt.

Die Visualisierung der Milz bei niedrigeren Vergrößerungen liefert einen Überblick über die mikrozirkulatorische Struktur des Organs. Fokussieren Sie die Milz mithilfe der Autofluoreszenz des Gewebes, wobei GFP-markierte Parasiten beobachtet werden können, wie sie die verschiedenen Bereiche der Milz durchlaufen. Hallo, mein Name ist Maria Albo von den Wissenschaftlichen und Technologischen Zentren der Universität Barcelona, und wir werden eine intravitale Bildgebung der Milz durchführen.

Um die Durchblutung und die Beweglichkeit infizierter roter Blutkörperchen zu untersuchen, verwenden wir ein konfokales Mikroskop mit einem resonanten Scanner, der eine Hochgeschwindigkeitsaufnahme ermöglicht, was sehr nützlich ist, um die Bewegung des Organs zu vermeiden. Dies ist ein spektrales Mikroskop, das die Auswahl des Sichtbereichs erlaubt. Um sehr schnell abbilden zu können, führen wir die gleichzeitige Aufnahme der beiden Fluorescein-Färbungen sowie der Reflexion durch.

Wählen Sie verschiedene Zonen zur Abbildung mit Hilfe von RBC-, Reflexions-, Kontrast- und Vidal-Färbungen, um die mikrovaskuläre Struktur der Milz sichtbar zu machen. Im Folgenden erklären wir, wie die Parasitenmotilität im Gefäßblutfluss mithilfe der Vidal-Mikroskopie und der Bildanalyse-Software ImageJ erfasst werden kann, um die Bewegung der Parasiten im dreidimensionalen Netzwerk des roten Pulps zu verfolgen. Erstellen Sie Aufnahmen durch fünf Z-Tiefenebenen unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Scanning-Modus.

Wandeln Sie Bildstapel in farbkodierte Z-Movies um, um die Verfolgung einzelner fluoreszierender Zellen zu erleichtern. Im Text wird detaillierte Information bereitgestellt, wie verschiedene Partikel über die Zeit hinweg anhand der Koordinaten X, Y, Z und T verfolgt werden können. Mithilfe von Beweglichkeitsparametern wie Gerichtetheit, mittlerer Geschwindigkeit und Verweildauer können Verteilungskarten erstellt werden, die einen vergleichenden Analysen zwischen Stamm-Populationen ermöglichen. Der vaskuläre Fluss in der Milz kann durch systemische Injektion mehrerer fluoreszierender Moleküle abgebildet werden, die in der unterstützenden Tabelle beschrieben sind, wie beispielsweise Dextrin.

Und mithilfe endogener Erythrozyten-Reflexionskontrast-Scans die zentrale Blutströmung erfassen, indem Gefäße horizontal zur Richtung des Laserscans ausgerichtet und die verbesserte Linienmittelung (enhanced Line average) verwendet wird. In diesen Bildern werden die durch bewegte Zellen entstehenden Streifen zur Berechnung des Blutflusses genutzt; es werden Aufnahmen von Gefäßen mit unterschiedlichen Durchmessern sowie über den Herzzyklus hinweg angefertigt, um Schwankungen auszugleichen. Die Milz galt lange Zeit als eine Black Box in der Malariaforschung; hier haben wir einen quantitativen Ansatz der intravitale Mikroskopie entwickelt, um Einblicke in die Dynamik der Parasiteninfektion und des Blutflusses in diesem Organ zu erhalten, was es uns ermöglicht, wichtige biologische Fragestellungen wie die in-vivo-Adhärenz infizierter roter Blutkörperchen an die Milz zu untersuchen.

Vielen Dank und.