Der Bau einer Kollagen-Hydrogel für die Lieferung von Stem Cell-beladenen Chitosan-Mikrokügelchen

Dieses Protokoll beschreibt eine In-vitro-Strategie, um Stammzellen aus Chitosan-Mikrosphären in ein Kollagen-Gel-Gerüst einzubringen, zu gewinnen und zu kultivieren. Die primären adipogenen Stammzellen emulgieren anschließend und gewinnen eine Aufbereitung von Chitosan-Mikrosphären zurück. Danach werden die Stammzellen auf die Chitosan-Mikrosphären ausgesät und in einem Kultivierungsplatteninsert mit einer Porengröße von acht Mikrometern kultiviert, um letztendlich ein CS-beladenes CSM herzustellen; abschließend wird das Mikrosphären-Abgabesystem mit einem dreidimensionalen Kollagen-Gel-Gerüst vermischt.

Schließlich bietet dieses CSM-System ein Potenzial für die Anwendung in der regenerativen Medizin und der Arzneimittelfreisetzung. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Zellinjektion oder Mikroverkapselung liegt in der Fähigkeit der Zellen, sich an ein Trägermaterial anzulagern und nach der initialen Applikation zu persistieren. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da esan-Mikrosphären eine inhärente statische Ladung aufweisen.

Und das Beladen von Zellen über ein Mikrokugelbett wird schwierig sein, ohne diese zu stören. Entfernen und waschen Sie das perineale und epidermale Fettgewebe von einem Hackfleisch, zerkleinern Sie das Gewebe, und überführen Sie anschließend ein bis zwei Gramm in 25 Milliliter HBSS, die 1 % FBS enthalten. Nach der Zentrifugation sammeln Sie die schwimmende Fettschicht in einem 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben.

Fügen Sie 25 Milliliter Kollagenase Typ zwei hinzu und inkubieren Sie die Reaktion in einem Rüttelinkubator. Entfernen Sie nun vorsichtig die flüssige Phase unterhalb der Ölschicht und der Fettgewebeschicht und filtrieren Sie nacheinander durch Nylon-Mesh-Filter mit einer Porengröße von 170 Mikrometern. Gewinnen Sie die Zellen durch Zentrifugation nach zwei Waschschritten mit jeweils 25 Millilitern.

HBSS Resus, das Pellet in 30 Milliliter ergänztem Mesen Pro Wachstumsmedium resuspendieren. Die gereinigten aus Fettgewebe stammenden Stammzellen auf zwei T-75-Kulturgefäße aufteilen und die ASC-Präparation in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C amplifizieren. Dieses CSM-Protokoll ist ein Wasser-in-Öl-Emulgierungsverfahren, das eine ionische Koazervationstechnik verwendet.

Emulgieren Sie sechs Milliliter einer wässrigen Chitosan-Lösung in 100 Milliliter einer Ölphasenmischung unter gleichzeitigem Rühren mit einem Oberflächenrührer und einem Magnetrührer in entgegengesetzten Richtungen eine Stunde lang, bis eine stabile Wasser-Öl-Emulsion entsteht. Geben Sie alle 15 Minuten 1,5 Milliliter 1%ige Kalilauge in n-Octan über einen Zeitraum von vier Stunden hinzu. Nach Abschluss der ionischen Vernetzungsreaktion wird die Ölphase langsam dekantiert und die Kugeln sofort zu 100 Milliliter Aceton gegeben. Waschen Sie die Kugeln mit Aceton, bis die Ölphase vollständig entfernt ist.

Anschließend die gewonnenen Sphären im Vakuum trocknen. Die durchschnittliche Partikelgröße der CSM, die Oberfläche pro Milligramm sowie das kubische Volumeneinheit mittels Partikelgrößenanalysator bestimmen. Danach die CSM dreimal mit steriler Wasser waschen, um restliche Salze zu entfernen.

Sterilisieren Sie nun die CSM-Zubereitung mit absolutem Alkohol für die Verwendung in Zellversuchen in einem 50-Milliliter-Glasröhrchen, mischen Sie fünf Milligramm Mikrokügelchen mit einem Milliliter 0,5-%-TNBS-Lösung und inkubieren Sie vier Stunden bei 40 Grad Celsius. Geben Sie danach drei Milliliter sechsnormaler Salzsäure hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden bei 60 Grad Celsius. Nach dem Abkühlen der Proben auf Raumtemperatur geben Sie fünf Milliliter entionisiertes Wasser und 10 Milliliter Diethylether hinzu.

Um das freie TNBS zu extrahieren, entnehmen Sie eine fünf Milliliter umfassende Aliquotprobe der wässrigen Phase und erwärmen Sie diese 15 Minuten lang auf 40 Grad Celsius in einem Wasserbad, um nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur eventuell verbliebene Reste von Ether zu verdampfen. Verdünnen Sie mit 15 Milliliter Wasser mithilfe eines Spektrophotometers. Messen Sie die Absorption der hergestellten Chitosan-Mikrosphären bei 345 Nanometern unter Verwendung von TNBS als Blindprobe.

Messen Sie ebenfalls das für die CSM-Herstellung verwendete Chitosan. Berechnen Sie nun die Anzahl der freien Aminogruppen des CSM im Verhältnis zur Gesamtanzahl der Aminogruppen in Chitosan. Puffern Sie fünf Milligramm des sterilisierten CSM über Nacht in steriler HBSS.

Überführen Sie das CSM in einen Membran-Einsatz mit acht Mikrometer für 24-Loch-Kulturplatten. Nachdem sich das CSM abgesetzt hat, aspirations Sie vorsichtig das HBSS. Geben Sie nun 300 Mikroliter Wachstumsmedium in das Innere des Einsatzes und 700 Mikroliter Wachstumsmedium auf die Außenseite des Einsatzes. Resus.

Suspendieren Sie die aus Fettgewebe stammenden Stammzellen in 200 Mikroliter Wachstumsmedium und säen Sie sie über die CSM in der Kulturplatte aus. Inkubieren Sie 24 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C. Überführen Sie die mit SC beladene CSM in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen, ohne die Zellen zu stören, die in die Insertmembran migriert sind.

Entfernen Sie nun das restliche Medium und geben Sie 250 µL frisches Wachstumsmedium zu jedem Reagenzglas hinzu. Fügen Sie 25 µL einer MTT-Lösung mit einer Konzentration von fünf Milligramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie vier Stunden lang. Entfernen Sie das Medium und geben Sie 250 µL Dimethylsulfoxid zu, wirbeln Sie die Probe, um den Formazankomplex aufzulösen, und zentrifugieren Sie die CSM bei 2.700 ×g fünf Minuten lang.

Messen Sie die Extinktion des Überstandes bei 570 Nanometern unter Verwendung von 630 Nanometern als Referenz. Bestimmen Sie anschließend die der CSM zugeordnete Zellanzahl relativ zum Extinktionswert, der von bekannten Zahlen vitaler A SC erhalten wurde. Mischen Sie fünf Milligramm einer mit SC beladenen CSM mit 7,5 Milligramm pro Milliliter Typ-I-Kollagen, das aus Ratten gewonnen wurde.

Schwanzsehne, den pH-Wert mit zwei normaler Natronlauge auf 6,8 einstellen und in eine Kulturschale geben. Zum Fibrillieren einsetzen, anschließend in eine 12-Loch-Platte überführen und 30 Minuten inkubieren. Erneuern Sie das Medium für die Kollagen-A-S-C-C-S-M-Gele alle zwei Tage während der Inkubationszeit weiterhin.

Überwachen Sie außerdem die Freisetzung und Migration von Zellen aus den CSM in das Gel mithilfe standardmäßiger Mikroskopietechniken. Das folgende Beispiel beschreibt die In-vitro-Strategie zur Abgabe von aus Fettgewebe stammenden Stammzellen aus Chitosan-Mikrosphären in ein Kollagen-Gel-Gerüst. REM- und TEM-Aufnahmen zeigen eine Herstellung poröser CSM einheitlicher Größe an.

Die Inkubation der Mikrosphären mit primären, aus Fettgewebe stammenden Stammzellen zeigt 4.000 Zellen pro Milligramm CSM-Calciumam. Die Färbung einer SC zeigt eine Ausbreitung über die CSM mit ausgestreckten Filopodien in die porösen Spalten der Mikrosphäre. Wenn die zellbeladenen CSM mit dem Kollagengel gemischt wurden, wandern die Zellen in das Gel ein und können über die Zeit verfolgt werden.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich unmittelbar auf die Therapie massiver und chronischer Gewebeverluste. Dennoch birgt dieses Behandlungsregime aufgrund seiner Vielseitigkeit, mit einer Vielzahl von Zellen und/oder Biomaterialien kombiniert zu werden, die zur Behandlung unterschiedlicher Grade von Weichgewebe- und Herztissueverlusten eingesetzt werden, ein weitaus größeres Potenzial. Zweifellos kann diese Methode Einblicke in die Abgabe von Wirtszellen liefern.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie beispielsweise Injektionspräparate zur Verabreichung von Wirkstoffen oder die Entwicklung hybrider Systeme zur gleichzeitigen Abgabe von Zellen und therapeutischen Wirkstoffen.