Projektierung eines zweischichtigen Hydrogel ASC Differenzierungskontrolle

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Verbundmatrix aus natürlichen Biomaterialien herzustellen, die zur gezielten Abgabe und Differenzierung von Stammzellen zur Unterstützung der Wundheilung eingesetzt werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst aus einem Versuchstier adipose Stammzellen oder a SC isoliert werden. Anschließend werden die A SC auf vorher hergestellte Chitosan-Mikrosphären aufgebracht.

Danach wird ein faseriges Kollagengel hergestellt, und die A-S-C-C-S-M-Kügelchen werden über das Kollagengel geschichtet. Abschließend wird ein PEG-Fibrin-Gel über das A-S-C-C-S-M-Kollagengel gegossen, und Medium wird hinzugefügt. Letztlich können Ergebnisse erzielt werden, die die bidirektionale gleichzeitige Migration von A SC aus der CSM-Kügelchen in beide Matrizes – Kollagen und PEG-Fibrin – zeigen.

Über dieses Verfahren kann eine einzelne Stammzellquelle differenzielle Signale aus der Kollagen- und PEG-Fibrin-Mikroumgebung aufnehmen und unterschiedlich stimuliert werden, pleiotrope Faktoren zu produzieren und ein Netzwerk prävaskulärer Strukturen zu bilden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Kompositen aus einem einzigen Material oder dezellularisierten Hautersatzstoffen liegt darin, dass diese anderen Produkte die Revascularisierung des Implantats durch den Wirt nicht aktiv fördern. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als wir beobachteten, dass isoliertes RAD A SE die Neigung aufweist, sich zu einem vaskulären Phänotyp zu differenzieren, wenn es in einer Schweinefibrin-Matrix kultiviert wird.

Diese Beobachtung führte zu der Annahme, dass eine einzige Stammzellquelle gleichzeitig in einem System verwendet werden könnte, das aus verschiedenen Biomaterialien bestand. Nach der Isolierung und Kultivierung von adipogenen Stammzellen oder ASCs, der Herstellung von Chitosan-Mikrosphären oder CSMs und dem Beladen der ASCs in die CSMs, wird ein Polyethylenglykol-Fibrin-Hydrogel hergestellt, indem succinyliertes Glutarat-modifiziertes PEG in vier Millilitern Tris-gepuffertem Salzlösung gelöst wird. Unmittelbar vor dem Experiment wird die Lösung mit einem 0,22-Mikron-Filter sterilisiert.

In einer Kulturmulde einer sechsmuldrigen Platte werden 500 µL Fibrinogen-Standardlösung und 250 µL PEG-Standardlösung 20 Minuten lang in einem feuchten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C inkubiert. Als Nächstes werden 250 µL zuvor hergestellte A-S-C-C-S-M mit der pegylierten Fibrinogenlösung gemischt, sofort 1 mL Thrombin-Standardlösung zugegeben und mit einer Pipette rasch ein- oder zweimal umrührt. Anschließend wird die Zell-Gel-Mischung unverzüglich in eine zwölfmuldrige Platte überführt und 10 Minuten lang in einer feuchten Kammer mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C inkubiert. Danach wird das resultierende Peg-Fibrin zweimal mit HBSS gewaschen und anschließend mit Alpha-Minimal Essential Medium, ergänzt mit 10 % FBS, in einem feuchten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C über einen Zeitraum von 11 Tagen unter Verwendung standardmäßiger Lichtmikroskopietechniken inkubiert.

Beobachten Sie die Migration der Zellen aus dem CSM in die Gel-Mischung, A-S-C-C-S-M, mit Typ-I-Kollagen, das aus Rattenschwanzsehnen mit zwei normalem Natriumhydroxid extrahiert wurde. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 ein und lassen Sie das Kollagen fibrillieren. Geben Sie die fibrillierte Kollagen-A-S-C-C-S-M-Mischung in eine 12-Loch-Platte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in einem feuchten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 °C.

Nach Überprüfung des vollständigen Fibrillationsprozesses die Kollagen-A-S-C-C-S-M-Gele bis zu 11 Tage lang in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator bei 37 °C inkubieren. Die Migration der Zellen aus dem CSM in das Gel über einen Zeitraum von 11 Tagen mithilfe standardmäßiger Mikroskopietechniken beobachten, um den Zweischicht-Konstrukt zur Untersuchung der Migrations- und Ko-Induktions-Eigenschaften einer einzigen Stammzellquelle zu entwickeln. Unter Verwendung von zwei biologischen Gerüsten.

Bereiten Sie sowohl das Kollagen- als auch das PEG-Fibrin-Gel mit den folgenden geringfügigen Modifikationen vor: Stellen Sie ein Milliliter einer Lösung mit 7,5 Milligramm pro Milliliter Kollagen her. Anschließend wird das Gemisch in ein sechswelliges Gewebekultur-Insert überführt und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach vollständiger Fibrillierung werden 200 Mikroliter von fünf Milligramm A-S-C-C-S-M im Kulturmedium auf die Kollagenoberfläche aufgegeben.

Nachdem sich die Mikrosphären auf dem Gel abgesetzt haben, bereiten Sie das PEG-Fibrin-Gel unter Verwendung von 250 Mikrolitern Zellkulturmedium vor. Anschließend schichten Sie die pegylierte Fibrinogen-Thrombin-Lösung über die A-S-C-C-S-M-Kollagenschichten. Nach Abschluss inkubieren Sie die Konstrukte 30 Minuten lang in einem mit 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator, um eine vollständige Gerinnung zu erreichen.

Schließlich 1 ml Medium in die obere Kammer über dem Konstrukt und 3 ml Medium in die untere Kammer geben. Die Charakterisierung einer SC, die in diesem Gerüst eingebettet ist, zeigte, dass eine SC-beladene CSM zwischen einer Schicht aus Kollagen und PEG-Fibrin gleichzeitig eingeschlossen werden kann und differenziell Signale aus beiden extrazellulären Umgebungen aufnehmen kann, um unter ihren neuen Bedingungen zu gedeihen. Wie hier gezeigt, unterstützte Kollagen die Fähigkeit der ASCs, Stammzellen zu bleiben, wie durch ihre Expression von Stro-1 in Grün sowie durch ihre fibroblastenähnliche Morphologie nachgewiesen wurde.

Im Gegensatz dazu induzierte PEG-Fibrin die Differenzierung der ASCs in ein avaskuläres Phänotyp, wie durch ihre hier gezeigte röhrenartige Morphologie mit Lumen und die endothelzellspezifische Expression des von-Willebrand-Faktors, dargestellt in Rot, belegt wird. Außerdem, wie hier gezeigt, schienen diese beobachteten Phänotypen früh im Kulturverlauf aufzutreten und über 11 Tage hinweg erhalten zu bleiben. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man adipose Stammzellen aus Ratten isoliert, sie auf Chito- und Mikrosphären aufbringt und in ein zweischichtiges Hydrogel unter Verwendung von FDA-zugelassenen Biomaterialien einbettet.

Vergessen Sie nicht, dass die in diesem Protokoll verwendeten Biomaterialien und Zellen von Tieren und Menschen stammen und äußerst gefährlich sein können, wenn sie mit von ihrem Wirt stammenden Krankheitserregern kontaminiert sind. Daher sollten stets Vorsichtsmaßnahmen wie der Einsatz von persönlicher Schutzausrüstung und aseptischen Zellkultivierungstechniken beachtet werden, wenn diese Verfahren durchgeführt werden.