Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr

Jane wechselte zum Entwicklungsmodell des Innenohrs der Maus mittels In-vivo-Elektroporation von Ling Wang, Han Jang und John Burgandy, Oregon Hearing Research Center, Oregon Health and Science University. Okay. Mein Name ist John Burgandy. Mein Labor befindet sich am Oregon Hearing Research Center der Oregon Health and Science University.

Mein Name ist Ang. Ich bin ein Poster in Johns Labor. Ich bin auch Ang in Johns Labor als wissenschaftliche Hilfskraft.

Unsere Darstellung gliedert sich in vier Teile. Der erste ist die ventrale Laparotomie. Wir zeigen die Natriumpentobarbital-basierte Anästhesie, wie die Angemessenheit der Anästhesie überprüft wird, den Hornhautschutz, die Vorbereitung des Operationsgebiets, das Desinfektionsprotokoll für die Überlebenschirurgie an Mäusen, den chirurgischen Bereich, den ventralen medianen Hautschnitt und den Schnitt durch die Bauchwand sowie die Externierung der Uterushörner.

Teil zwei ist die transuterine Mikroinjektion. Wir demonstrieren die Durchlichtbeleuchtung des Embryos, die Umorientierung des Embryos, die Mikroinjektion, die Herstellung von Pipetten und die Mikroinjektion in den Otis am embryonalen Tag 11,5 und am embryonalen Tag 12,5. Teil drei ist die in-vivo-Elektroporation.

Wir demonstrieren die Elektrodenplatzierung im Paddel-Stil und die Elektroporation des 11,5 Tage alten embryonalen Maus-Ohrinnenohrs. Teil vier zeigt repräsentative Ergebnisse. Wir zeigen die Expression von GFP in späten embryonalen und frühen postnatalen Cochleae.

Das Ergebnis stammte aus einer in vivo-Elektroporation des Otis mit Expressionsplasmid am embryonalen Tag 11,5, Teil eins: ventrale Laparotomie. Die trächtige Maus wird festgehalten, indem man die Haut hinter dem Nacken, den Schwanz und das linke Hinterbein greift. Nach Abwischen des Abdomens mit 70 %igem Ethanol wird eine intraperitoneale Injektion eines auf Natriumpentobarbital basierenden Anästhetikums verabreicht.

Die Maus wird für vier bis fünf Minuten in ihren Heimkäfig gebracht, um die Wirkung des Anästhetikums zu ermöglichen. Fuß- und Schwanzquetschungen werden verwendet, um die ausreichende Anästhesie zu beurteilen. Diese Damm reagiert noch auf die Schwanzquetschung und benötigt weitere zwei Minuten, bis sie nicht mehr auf nozizeptive Reize reagiert.

Sterile Augensalbe wird auf die Augen aufgetragen, um die Hornhäute vor Austrocknung zu schützen. Wir bereiten den Operationsbereich in einer chemischen Abzugshaube vor, um die Verbreitung von Fell und Hautschuppen zu minimieren. Das Fell wird mit einer feinen Klinge abrasiert, um die Haut freizulegen, die die Bauchdecke bedeckt.

Die vollständige Entfernung des Fells erleichtert die postoperative Heilung des Schnittes. Die Desinfektion der Bauchhaut erfolgt durch abwechselndes Abwischen mit 70 % Ethanol, Betadine und erneut 70 % Ethanol. Wischen Sie dabei stets von kranial nach kaudal und verwenden Sie jeweils eine neue sterile Watte oder einen Wattestäbchen.

Für jeden Wischvorgang bewerten wir die Tiefe und Qualität der Atmung während der Desinfektion, um sicherzustellen, dass die Dammus unbelebt ist. Unmittelbar nach dem zweiten Wischvorgang mit 70 % Ethanol legen wir die Dammus mit der Bauchseite nach unten auf ein steriles Tuch und platzieren sie für zwei bis drei Minuten auf einer beheizten Unterlage, um sie aufzuwärmen. Dies ist ein geeigneter Zeitpunkt, um die präoperativen Daten im Protokollblatt für die Überlebenschirurgie an Mäusen zu dokumentieren. Unser Protokollblatt für die Überlebenschirurgie an Mäusen haben wir als ergänzende Information beigefügt.

Ziehen Sie die Einbeziehung des Datensatzes und Ihres Tierversorgungsprotokolls in Erwägung, damit Ihr institutionelles Tierversuchsausschuss nachvollziehen kann, wie Sie präoperative, intraoperative und postoperative Daten überwachen werden. Für jeden chirurgischen Versuchstier führen wir ein Protokollblatt. Wir bevorzugen die Durchführung der Operation in einer sterilen Umgebung, obwohl dies für Nagetiere in der Regel nicht erforderlich ist.

Die Arbeitsfläche ist getrennt vom Gebläsemotor und der Plenum-Haube, sodass keine Vibrationen an den Benutzer weitergeleitet werden. Während der Mikroinjektion haben wir als ergänzende Information ein Schaltbild der Modifikationen beigefügt, die wir an unserer laminarer Luftstrom-Haube vorgenommen haben, um die Genübertragung in utero zu erleichtern; die wesentlichen Änderungen sind Aussparungen für eine niedrige Wasserwanne und Bahnenbeleuchtung sowie versteckte Steckdosen für die Netzkabel der Instrumente und ein Führungsweg für zusätzliche elektrische Leitungen. Die Operationsstation besteht aus dem elektrischen IV-Beutel mit lactatisierten Ringer-Lösung, einem Warmwasserbad, einem XY-, Z-Manipulator, einem stereoskopischen Fluoreszenz-Mikroskop, einer Lichtquelle mit Glasfaser, und chirurgischen Instrumenten.

Footpedale werden verwendet, um den Mikroinjektor auszulösen, Elektroperter in den Fokus zu bringen. Die chirurgischen Instrumente für das Mikroskop werden in einem Autoklaven sterilisiert. Die Instrumente müssen zwischen den Mäusen mithilfe eines Glasperlen-Sterilisators oder durch erneutes Autoklavieren der Nadelhalter erneut sterilisiert werden.

Balli-Scheren, Ringpinzette und vaskuläre Pinzette sind die wesentlichen Instrumente. Vornahme eines medianen ventralen Längsschnitts, Ergreifen der Haut mit der vaskulären Pinzette und Entfernen des Integuments mit der Ballspitzen-Schere; den Schnitt um 10 bis 14 Millimeter verlängern. Die weiße, avaskuläre Bindegewebsband, die als Linea alba bezeichnet wird, identifizieren und entlang der ventralen Mittellinie des Abdomens die Linea alba mit der Ballspitzen-Schere incisieren.

Dabei vorsichtig sein, um den Darm oder die inguinalen Fettgewebe nicht zu verletzen. Unverzüglich den Bauchraum mit steriler, vorgewärmter Ringer-Lösung spülen. Die Inzisionsstellen in der Haut und der Bauchwand auf Blutungen überprüfen.

Durch direkten Druck mit einer stumpfen Pinzette lässt sich eine geringfügige Blutung gegebenenfalls stillen; anschließend mit ringförmiger Pinzette die rechte und linke Uterushorn ausstülpen. Fassen Sie vorsichtig das rechte Uterushorn mit einem ringförmigen Ende der Pinzette und ziehen Sie die Gebärmutter in Richtung der medianen Inzision. Benutzen Sie Ihre freie Hand, um die seitliche Seite der Dammgegend sanft zu manipulieren und so das Haken der Gebärmutter zu erleichtern.

Die Pinzette wird niemals dazu verwendet, die Gebärmutter zu komprimieren und herauszuziehen. Da dies die uterinen Blutgefäße oder die Embryonen beschädigen könnte, wiederholen Sie den Externationsvorgang für das linke Uterushorn. Spülen Sie die neu externierten Uterushörner unverzüglich vorsichtig mit vorgewärmter Ringer-Laktatlösung aus und bringen Sie die Fettgewebepolster oder den Darm, falls sie zusammen mit der Gebärmutter nach außen treten, sofort wieder zurück.

Dies tritt nicht häufig auf. Teil zwei: mikroinjektion in den Uterus. Das Weibchen wird unter dem Objektiv mit großer Arbeitsdistanz positioniert, und ein weiches Kabel mit einer faseroptischen Lichtquelle wird an der Uteruswand angebracht.

Der Uterus wird mit einem Finger der freien Hand vorsichtig gedrückt, um die Identifizierung der Embryonalorientierung zu erleichtern. Das Licht des Glasfaserkabels sollte mit der geringsten Intensität eingestellt werden, die erforderlich ist, um die Orientierung des Embryos genau beurteilen zu können.

Intensives Licht kann Wärme auf den Uterus übertragen, was Komplikationen verursachen könnte. Wir halten die Lichtfaser und den Uterus mit einer Hand und verwenden einen Finger der freien Hand, um das Embryo durch sanfte Palpation neu zu positionieren. Im Folgenden zeigen wir anhand von drei Mikroskopie-EC-Klips die gängigen Embryo-Orientierungen innerhalb des Uterus.

Der Betrachter sieht die mikroskopische Ansicht, die wir während der Durchlichtbeleuchtung wahrnehmen, wobei die Durchlichtbeleuchtung der Gebärmutter in Schwarz-Weiß die Erfassung der Embryonalorientierung in vivo ermöglicht. In diesem Beispiel befindet sich der Embryo in einer Kopfstandposition, wobei seine ventrale Seite dem Betrachter zugewandt ist. Durch Hin- und Herbewegen der Gebärmutter können wir die rechten und linken Hintergliedmaßen, den Schwanz sowie das linke Auge des Cephalons erkennen.

In diesem Beispiel befindet sich der Embryo erneut in der Kopfstandposition, ist jedoch um etwa 90 Grad bezüglich der anterioren-posterioren Achse gedreht. Durch vorsichtiges Hin- und Herbewegen der Gebärmutter können wir die paddelartigen Strukturen erkennen, die das linke Hinterbein und das linke Vorderbein definieren. Auch das Rückenmark ist deutlich sichtbar.

Das Embryo befindet sich in aufrechter Position mit seiner linken Seite, die dem Betrachter zugewandt ist. Das entstehende vierte Ventrikel ist als heller Fleck im Rückenhirn erkennbar. Der linke Augenkegel, die linke vordere Extremität und die linke hintere Extremität sind ebenfalls deutlich sichtbar.

Durch sanften Druck auf die Gebärmutter werden die Embryonen leicht neu ausgerichtet, wodurch die Hauptschlagader der primären Kopfvene und ihre vordere und hintere Verzweigung sichtbar werden, die jeweils mit weißem und schwarzem Sternchen markiert sind. Wie wir sehen werden, liegt das Otis genau in der Mitte zwischen den vorderen und hinteren Ästen der primären Kopfvene. Das Otis selbst ist durch die Gebärmutter hindurch mittels Durchlichtbeleuchtung nicht sichtbar.

Wir zeigen in zwei aufeinanderfolgenden Videomikroskopieaufnahmen, wie man das Embryo für die Mikroinjektion in die Otis-Hilfsstruktur neu ausrichtet. Das Ziel besteht darin, die embryonalen Orientierungspunkte zu identifizieren, die die Interpolation der Lage der Otis im seitlichen Kopfbereich ermöglichen. Mesen con, unser Ziel ist es, das Embryo von der dorsalen in die laterale Position umzudrehen, damit wir die primäre Kopfvene identifizieren können.

Das Mesencephalon, das vierte Ventrikel und die linke Extremitätenanlage sind in dorsaler Lage erkennbar. Sanfter Druck auf die Gebärmutter verändert die Ausrichtung des Embryos von dorsal zu laterodorsal. Das linke Auge, das Cephalon, das Mesencephalon und das vierte Ventrikel sind deutlich sichtbar.

Die Primärvene des Kopfes und ihr hinterer Zweig, die durch das Sternchen markiert sind, sind ebenfalls deutlich erkennbar. Der vordere Zweig der Primärvene des Kopfes ist nicht eindeutig nachweisbar. Unser Ziel besteht erneut darin, das Embryo so auszurichten, dass die Primärvene des Kopfes identifiziert werden kann, jedoch unter höherer Vergrößerung, die für die mikrochirurgische Injektion in die Gebärmutter geeignet ist.

Die Uterusgefäße, das decidual Band und das linke Auge sind in dieser seitlichen Ansicht zu sehen. Sanfter Druck auf den Uterus verändert die Lage des Embryos, sodass wir das vierte Ventrikel und das linke Auge erkennen können. Die primäre Kopfvene und ihr hinterer Zweig, markiert durch das Sternchen, bilden zusammen mit ihren Ästen die Form einer aufrechten amerikanischen Football-Torvorrichtung.

Die Ohrbläschen sind nicht durch die Gebärmutter sichtbar, befinden sich jedoch in der Mitte der aufrechten Strukturen. Lynn hat eine Injektionssequenz für ein Embryo begonnen. Sie transilluminert die Gebärmutter, richtet den Embryo für eine Mikroinjektion neu aus und führt die mit Fast Green gefüllte Mikroinjektionspipette in das Sichtfeld ein.

Die Mikroinjektionspipette ist an einen Pipettenhalter angebracht, der von einem X-, Y-, Z-Mikromanipulator gehalten wird. Der magnetische Standfuß des Manipulators ist an einer Stahlplatte mit Teflonbasis befestigt, die eine mühelose Grobpositionierung der Mikroinjektionspipette ermöglicht. Die Nadel wird durch geeignetes Betätigen des vorderen Mikrometerschubs am Manipulator vorgerückt.

Hergestellte Pipetten sind entscheidend für eine schonende Mikroinjektion in das frühe Otis-Stadium des Maus-Embryos. Wir ziehen kapillares Borosilicatglas mit dicker Wandung mithilfe eines horizontalen Pipettenziehgeräts. Die resultierende Pipette, wie in A dargestellt, wird manuell mit einer Pinzette an der durch den Pfeil in B markierten Position mit einem Außendurchmesser von etwa 14 bis 16 Mikron gebrochen. Der grobe Bruch der Pipette, wie in C gezeigt, ist gezackt und zerbrechlich.

Wir schleifen die Pipette unter einem Winkel von etwa 20 Grad, um die Pipettenspitze zu verfeinern, wie in Panel D gezeigt; die Parameter zum Ziehen und Schleifen von Mikroinjektionspipetten sind im begleitenden Text angegeben. Wir demonstrieren in den nächsten beiden Videomikroskopieaufnahmen die Mikroinjektion in das embryonale Maus-Otik am 11,5. und 12,5. Entwicklungstag. Unser Ziel ist es, die uterine Mikroinjektion in das Ohr der Maus am 11,5. Embryonalentwicklungstag zu zeigen.

Zunächst injizieren wir die Otoide ohne das Vorhandensein des Uterus, um eindeutig darzustellen, wie eine korrekt gezielte Injektion aussieht. Anschließend demonstrieren wir eine echte transuterine Mikroinjektion. Bei dieser ersten Injektion wurde der Uterus vollständig eröffnet, um das viszerale Sack ausstülpen zu lassen; das die viszerale Dottersackmembran überlagernde decidualen Band wurde entfernt.

Die Plazenta bleibt an der Gebärmutter angeheftet und der Embryo ist lebendig. Nach fokaler Entfernung der Gebärmutter sind das vierte Ventrikel, die primäre Kopfvene sowie ihre vordere und hintere Verzweigung, die Pipette und die ungefähre Lage der Zyste in Weiß zu erkennen. Zu Beginn dieser Injektionssequenz wird Blutfluss in der Gefäßstruktur des viszeralen Dottersacks nachgewiesen.

Die Pipette wird durch das viszerale Dottersackepithel vorgeschoben, und das DAI wird in die Osis-Injektionsstelle, den endolymphatischen Gang dorsal und die Position der Oticus-Region im Zentrum der aufrechten Strukturen injiziert. Die Oticus-Region liegt in der Mitte zwischen dem vorderen und hinteren Ast der primären Kopfvene. Für die intrauterine Mikroinjektion in den embryonalen Tag 11,5-Maus-Oticus ist die Identifizierung der primären Kopfvene und mindestens eines ihrer Äste erforderlich, um die Lage des Oticus-Assistenten abzuschätzen.

Unser Ziel in diesem schematischen Beispiel ist es, sowohl den vorderen als auch den hinteren Ast der primären Kopfvene mit dem in Weiß markierten OUC-Gebiet nachzuweisen. Eine realistischere Darstellung des Embryos zeigt den Hauptstamm der primären Kopfvene zusammen mit nur einem ihrer Äste; im dargestellten Beispiel ist lediglich der hintere Ast der primären Kopfvene sichtbar, doch das genügt bereits, um die Lage der Otolithen zu interpretieren. Der PT wird durch die Gebärmutter vorgeschoben, und Farbstoff wird in die Otolithen injiziert.

Wir warten 30 Sekunden, um dem Farbstoff Zeit zu geben, sich aus der Fruchtblase zu entfernen. Zu diesem Zeitpunkt ist der Endolympfkanal dorsal und das Vestibulum sichtbar. Zum Abschluss zeigen wir eine Ansicht des Embryos mit geringer Vergrößerung, dessen Zyste wir gerade injiziert haben, um einen anatomischen Überblick zu geben; in dieser Ansicht sind das vierte Ventrikel, das linke Auge und die uterine Gefäßversorgung erkennbar. Wir demonstrieren die Trans- und Mikroinjektion in die otische Zyste der embryonalen Maus am Tag 12 sowie die Mikroinjektion in das sich bildende vierte Ventrikel des Nachhirns.

Die Durchlichtbeleuchtung ermöglicht es uns, in dieser linken Seitenansicht sowohl die primäre Kopfvene als auch das Auge zu erkennen. Die Pipette wird durch den Uterus in die Ohrbläschen vorgeschoben und Farbstoff injiziert, um deren Lumen zu füllen. Um das vierte Ventrikel zu injizieren, drehen wir das Embryo um 90 Grad in eine dorsale Ansicht des Hirnrückens.

Die injizierte linke Zyste befindet sich nun auf der linken Seite. Die Pipette wird durch den Uterus vorgeschoben und Fast Green wird mit Lor gemischt. Konjugiertes Dextran wird in das vierte Ventrikel injiziert.

Beachten Sie, dass das injizierte Farbstoffvolumen nicht in den Mittelhirnbereich in vivo gelangt. Die Fluoreszenz wird nach der Injektion überprüft, um die Lokalisation des Dextrans im vierten Ventrikel zu bestätigen. Anschließend wird das Embryo von der dorsalen in die laterale Position umorientiert.

Der endolymphatische Gang liegt in dieser Seitenansicht gerade ventral zum vierten Ventrikel. Die In-vivo-Fluoreszenz bestätigt die Lokalisation des Dextrans im vierten Ventrikel. Bei der Geburt untersuchen wir die Welpen mittels Epi-Fluoreszenz auf grüne Fluoreszenz im vierten Ventrikel.

Unter dem Stereomikroskop zeigen Welpen mit grüner Fluoreszenz in ihrem Hinterhirn ein Innenohr, das während der Embryogenese im dritten Teil mittels in-vivo-Elektroporation manipuliert wurde. Nachdem die Zyste mit Expressionsplasmid gefüllt wurde, wird der Uterus frisch mit vorgewärmter Ringer-Laktatlösung durchspült. Die Durchlichtbeleuchtung erleichtert die Zentrierung der ODU-Zyste im Elektrodenfeld.

Der Metallkopf des faseroptischen Lichts wird von der Uterusoberfläche zurückgezogen. Bevor wir die Rechteckimpulsfolge starten, zeigen wir im nächsten Videomikroskopieausschnitt einen vollständigen Elektroporationszyklus in vivo. Für die Elektroporation der otischen Zyste der Embryonalen Tag 11,5-Maus ist eine schonende Platzierung der löffelförmigen Elektroden am Uterus erforderlich.

In diesem Beispiel wurde die linke Ohrblase mit Expressionsplasmid gefüllt und die Gebärmutter frisch mit Ringer-Laktatlösung gespült. Die Kathode ist bezüglich der gefüllten Ohrblase lateral positioniert, und die Anode ist medial platziert, zu Beginn der Impulssequenz befindet sich die Ohrblase in der Mitte des Paddelfelds. Die Gebärmutter wird sanft komprimiert, und die Rechteckimpulsfolge wird mittels Fußschalter ausgelöst.

Pro Puls sollten idealerweise 60 bis 100 Milliampere Strom übertragen werden. Anschließend wird die Gebärmutter gelöst und unmittelbar gespült. Die frisch gespülte Gebärmutter wird durch vorsichtigen Druck mit der Ringzange wieder in die Bauchhöhle zurückgeführt.

Nachdem der Uterus eingelegt wurde, wird die Bauchhöhle mit etwa vier Milliliter Ringer-Laktatlösung gespült, wobei etwa ein Milliliter Ringer-Laktat in der Bauchhöhle verbleibt, um die Hydratation der Dams zu erhalten, die unmittelbar nach einer Bauchoperation weniger Wasser trinken wird. Die Bauchwand und anschließend die Haut werden mit resorbierbarem Nahtmaterial unter Verwendung eines Nadelhalters verschlossen. Unser Nadelhalter verfügt über eine integrierte Schere, die das Vernähen vereinfacht.

Wir bevorzugen einen Laufstich sowohl für die Bauchdecke als auch für die Haut. Jeden zweiten Stich verknoten wir, um zusätzliche Stabilität an der Inzisionsstelle zu gewährleisten. Vor dem Einsetzen des Tieres in den Erholungskäfig verabreichen wir ein nichtsteroidales entzündungshemmendes Medikament subkutan.

Rücksprache mit dem Tierarztteam halten, welche prophylaktischen Analgetika von dem Tierversuchsausschuss der Institution bevorzugt werden. Die Gebärende wird in ein steriles Tuch eingehüllt und auf den Boden des beheizten Erholungskäfigs gelegt. Der Erholungskäfig enthält Nistmaterial, eine rote Röhre als Versteckmöglichkeit, Laborfutter und eine Wasserkaraffe.

Der Käfig wird am Morgen nach der Operation mit einem Filterhaubenoberteil wieder zusammengesetzt. Die Muttertier ist gut gepflegt, beweglich und in der Lage, auf ihren Hintergliedmaßen zu balancieren, um das geöffnete Käfigoberteil zu untersuchen. Die Nahtlinie im Bauchbereich ist sauber, trocken und zeigt keine Anzeichen von Wunddehiszenz, Rötung oder Schwellung.

Wir haben ein Dokument angehängt, das die Entwicklung von Protokollen zur Tierversuchstierpflege für die Gentransfer-Untersuchung in utero behandelt. Das Dokument enthält Formulierungen, die bei der Erstellung eines institutionsbezogenen Protokolls in Abstimmung mit Ihrem Ausschuss für Tierpflege und Tierversuche hilfreich sein können. Teil vier, repräsentative Ergebnisse.

Die repräsentativen Ergebnispaneele A und B zeigen eine repräsentative Cochlea eines sechstägigen postnatalen Welpen, dessen Otis am embryonalen Tag 11,5 mit einem Plasmid zur verstärkten Expression von grün fluoreszierendem Protein injiziert und anschließend elektroporiert wurde. Die laterale Wand der Cochlea wurde aus dem Mittel- und dem Apexbereich entfernt. Nur im Bereich von der Basis bis zum Mittelteil der Cochlea ist GFP-Expression nachweisbar, die der Verteilung des Haarzellen-Markers Myosin sieben A entspricht, wie in Panel B dargestellt. Panel C zeigt eine Aufnahme mit geringer Vergrößerung mittels konfokaler Projektion des embryonalen Tages.

18,5 Tage altes Mausorgan des Corti, immunhistochemisch gefärbt mit einem Myosin-Sieben-A-Antikörper. Transfizierte Zellen sind im gesamten Organ des Corti verteilt. Panel D zeigt eine konfokale Projektion mit hoher Vergrößerung des embryonalen Tages 18,5 Mausorgan des Corti, gefärbt mit Cin.Sieben.

Ein GFP-Ausdruck wird in inneren und äußeren Haarzellen, Interphalangealzellen, Stützzellen und TER-Zellen nachgewiesen. Die Elektroporation vermittelte Genübertragung in das Ohr am embryonalen Tag 11,5 transfiziert Vorläuferzellen, die zu allen Zelltypen des Corti-Organs heranreifen.