Die Quantifizierung der Aktivität von Cis-Regulatorische Elemente in der Maus Retina durch Explantation Elektroporation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszierende transkriptionelle Reporter in murinen Netzhautimplantaten mittels Elektroporation zu übertragen und deren Expressionslevel zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zuerst neugeborenes murines Netzhautgewebe durch Dissektion isoliert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Netzhaut mit fluoreszierenden DNA-Reporterkonstrukten zu elektroporieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die elektroporierten Netzhäute acht Tage lang als Implantate zu kultivieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Gewinnung des retinalen Explantats und die Quantifizierung der Expressionslevel der fluoreszierenden Reporter. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die relativen Expressionslevel verschiedener Promotor-Reporter-Konstrukte in der sich entwickelnden Mausnetzhaut mittels x-Explant-Elektroporation gefolgt von einer quantitativen Datenanalyse zeigen.

Mein Name ist Joe Corbo und ich bin Mitglied der Fakultät der Abteilung für Pathologie und Immunologie an der Medizinischen Fakultät der Washington University in St. Louis. Heute werden wir ein Video-Protokoll präsentieren, das die Technik der X-explan-Elektroporation in neugeborene Mausretinen demonstriert, um die Aktivität von photorezeptorspezifischen CYS-regulatorischen Elementen zu quantifizieren. Dieses Protokoll wird von einer Doktorandin aus meinem Labor, Cindy Montana, vorgeführt. Desinfizieren Sie zunächst die Elektroporationskammer und alle Instrumente mit 70 %igem Ethanol, um die Augensammlung vorzubereiten.

Desinfizieren Sie sowohl die Handschuhe als auch die Laboroberfläche mit Ethanol und halten Sie während des gesamten Verfahrens sterile Bedingungen ein. Geben Sie anschließend in einer Zellkulturhaube sechs Milliliter Dissektionsmedium in eine sterile 60-Millimeter-Petri-Schale und jeweils drei Milliliter Medium in zwei sterile 35-Millimeter-Schalen. Zurück an der Laborbank desinfizieren Sie den Kopf und den Hals eines neugeborenen Mäusewelpen mit 70 %igem Ethanol.

Nachdem der Kopf mit einer Schere schnell abgetrennt wurde, überführen Sie den Kopf in eine sterile 100-Millimeter-Schale und entfernen mit einer kleinen Schere die Kopfhaut, um die Augen unter einem Stereomikroskop freizulegen. Heben Sie mit einer gebogenen Pinzette vorsichtig das Auge aus der Augenhöhle und legen Sie es in eine 35-Millimeter-Schale, die Dissection.Medium enthält. Sammeln Sie weiterhin Augen, sodass drei bis vier Augen pro Aliquot DNA vorliegen, die elektroporiert werden sollen, und bewahren Sie die Augen sowie das Dissektionsmedium bei Raumtemperatur auf, bis die Sammlung abgeschlossen ist.

Desinfizieren Sie sowohl eine Rasierklinge als auch die Verpackung einer sterilen Plastik-Transferpipette mit 70 % Ethanol und schneiden Sie dann mit der Rasierklinge die Spitze der Pipette so weit oben ab, dass ein gesamtes Auge aufgenommen werden kann. Übertragen Sie mithilfe der verbreiterten Pipette ein Auge von der 35-Millimeter-Schale in die 60-Millimeter-Schale unter einem Auflichtmikroskop bei hoher Vergrößerung. Entfernen Sie mit feinen Pinzetten jegliches Gewebe wie Augenmuskeln und Fett vom Augenoberfläche.

Entfernen Sie dann den Sehnerv, indem Sie ihn an der Basis abquetschen. Um die Netzhaut zu isolieren, stechen Sie ein kleines Loch in die Sklera am Limbus; die Sklera und das retinale Pigmentepithel erscheinen glänzend im Vergleich zum Netzhautgewebe, das mattgrau ist. Führen Sie eine Zange von beiden Pinzettenpaaren in das Loch ein und reißen Sie vorsichtig die Sklera und das RPE auf.

Stellen Sie sicher, dass die Linse an Ort und Stelle bleibt. Verwenden Sie die erweiterte Pipette, um die präparierte Netzhaut in die zweite 35-Millimeter-Schale mit Medium zu überführen. Sammeln Sie alle Netzhäute und lagern Sie sie in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius.

Bis zur Elektroporation, die in einer Zellkulturfume arbeitet, für jede zu elektroporierende DNA-Eloqua, füllen Sie eine sterile 35-Millimeter-Schale mit Dissektionsmedium und eine zweite Schale mit Kulturmedium. Spülen Sie mit einer P200-Pipette die Kammern in der Elektroporationschale dreimal mit steriler 1×PBS aus. Füllen Sie die Kammern mit den 60-Mikroliter-DNA-Aliquoten und füllen Sie alle ungenutzten Kammern mit jeweils 60 Mikrolitern 1×PBS.

Verbinden Sie die Elektroden mit der Elektroporationsplatte und geben Sie die geeigneten Einstellungen am Elektrogerät ein. Greifen Sie die Netzhäute mit feiner Pinzette an der Linse und überführen Sie sie in die Elektroporationskammern. Platzieren Sie bis zu vier Netzhäute in jeder Kammer.

Ordnen Sie die Netzhäute so an, dass die Linse gegen den Metallstab gelehnt ist, der an der positiven Elektrode befestigt ist. Wischen Sie die Pinzette nach jeder Kammer ab, um eine Übertragung von DNA von einer Kammer zur nächsten zu vermeiden. Sobald alle Netzhäute ausgerichtet sind, drücken Sie auf Start am Elektrogerät.

Winzige Bläschen sollten sich an dem Metallstab bilden, der an der negativen Elektrode befestigt ist. Trennen Sie die Elektroden und schalten Sie das Gerät mit einer Pinzette aus. Bewegen Sie die Netzhäute vorsichtig von den Kammerwänden weg.

Überführen Sie die Netzhäute aus den Kammer in die 35-Millimeter-Schalen, die das Dissektionsmedium enthalten. Überführen Sie mithilfe einer sterilen Transferpipette die Netzhäute aus dem Dissektionsmedium in die 35-Millimeter-Schalen, die Kulturmedium enthalten. Beschriften Sie die Vertiefungen einer sterilen sechswelligen Kulturplatte und füllen Sie jede Vertiefung mit drei Milliliter Kulturmedium.

Verwenden Sie sterile Pinzette, um runde Watman-Nukleofilter auf der Oberfläche des Mediums in jedem Brunnen schwimmen zu lassen, wobei die glänzende Seite der Filter nach oben zeigt. Mit Hilfe eines Stereomikroskops übertragen Sie eine einzelne Netzhaut mit einer sterilen Transferpipette auf den Filter, wobei die Linsenseite nach unten zeigt. Falls die Netzhaut mit der Linsenseite nach oben landet, saugen Sie sie wieder in die Pipette auf und versuchen Sie es erneut.

Legen Sie nicht mehr als vier Netzhäute in jede Vertiefung und halten Sie sie in separaten Tropfen. Sobald die Netzhäute in die Vertiefungen gelegt wurden, bringen Sie die Kulturplatte in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und kultivieren Sie sie für die gewünschte Dauer. Üblicherweise nach acht Tagen zeigt sich hier ein erfolgreicher Elektroporationsresultat in der Expression des DNA-Konstrukts über ein Viertel bis ein Drittel der Netzhautoberfläche.

Die Fluoreszenzniveaus werden quantifiziert, indem uniform elektroporierte Bereiche, die den CRE-Konstrukt ausdrücken, mit Bereichen außerhalb der Netzhaut verglichen und anschließend auf die Kontroll-Expression von GFP normalisiert werden. Insbesondere Stäbchenphotorezeptoren werden effizient transduziert, wie gezeigt. Hier sind die Ergebnisse einer Elektroporation, bei der zwei auf Stäbchen spezifische Promotoren die Expression von GFP und DS-rot in der äußeren nukleären Schicht steuern.

Durch die Überlagerung der beiden Expressionsmuster mit der hier in Blau dargestellten DPI-Färbung wird die photorezeptorspezifische Expression deutlich. Es wird keine Expression in der intermediären Schicht oder in der Ganglienzellschicht beobachtet. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man Elektroden präpariert und Maus-Retina-Explantate kultiviert, um die Aktivität retinaler Zysten-regulatorischer Elemente zu quantifizieren.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.