Radioaktiv In-situ- Hybridisierung zum Nachweis Diverse Genexpressionsmuster in Tissue

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Regionen spezifischer Genexpression zu identifizieren und den Zeitpunkt sowie die Intensität der Genexpression zu charakterisieren, um zum Verständnis der Genfunktion beizutragen. Dies wird erreicht, indem das Gewebe schnell geerntet und für das Verfahren vorbereitet wird, um die Gewebeintegrität zu bewahren. Als zweiter Schritt wird das Gewebe behandelt, um die unspezifische Bindung von Ribo-Sonden zu verringern.

Anschließend werden die Ribo-Sonden an das Gewebe hybridisiert und die Bindung der RIBA-Sonde wird sichtbar gemacht. Durch die Verwendung von Röntgenfilm oder lichtempfindlicher Emulsion erhält man Ergebnisse, die die Lokalisation und das Ausmaß der Genexpression anhand von Röntgenaufnahmen oder Dunkel- und Hellfeldmikroskopie sowie deren Analyse zeigen. Bei der Nutzung der Image-J-Software gibt es mehrere kritische Schritte, die korrekt durchgeführt werden müssen und bei denen viele Personen Fehler begehen; einer davon ist die Vermeidung von Hintergrundfärbung.

Es gibt daher eine Reihe von Schritten, die Hintergrundgeräusche verursachen können, wie beispielsweise eine schlechte Sation oder das Hybridisieren bei falscher Temperatur. Ein weiterer Faktor ist RNA-Kontamination, die Ihre RNA-Sonde abbauen wird. Daher müssen Sie sorgfältig darauf achten, dass alle Materialien frei von RNasen sind.

Und drittens muss sichergestellt werden, dass beim Eintauchen der Objektträger in die Emulsion keine Lichtundichtigkeiten im Dunkelraum bestehen oder die Emulsion während sämtlicher Stufen dieses dreiwöchigen Prozesses ungewollt belichtet wird. Diese Technik wird Hun Chen demonstrieren, ein Postdoktorand in meinem Labor. Nach der Gewinnung eines frischen Gehirns und dem Spülen in 1× PBS wird das Gehirn in OCT-Gewebe-Einbettungsmedium eingebettet, indem das Gehirn in eine Form getaucht wird, die das Medium bei Raumtemperatur enthält.

Stellen Sie sicher, dass das Gehirn für den Schnitt entsprechend ausgerichtet ist. Danach sprühen Sie Ethanol auf das Trockeneis und frieren das Gewebe ein, indem Sie den Block in die Mischung aus Ethanol und Trockeneis legen. Achten Sie darauf, dass kein Ethanol in den Block gelangt, und schneiden Sie das gefrorene Gewebe mit einem Kryostaten in 10 bis 12 Mikrometer dicke Schnitte, die auf Super-Plus-Objektträgern für Gehirn- und embryonales Gewebe aufgebracht werden.

Die optimale Schneidtemperatur liegt im Bereich von minus 18 Grad Celsius bis minus 20 Grad Celsius. Lagern Sie die Schnitte in einer Objektträgerbox bei minus 80 Grad Celsius. Überführen Sie die Objektträger aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius auf ein Metallgestell mit Trockeneis.

Dann platzieren Sie den Rack in einer Lösung mit 4 % Paraformaldehyd, die auf drei bis fünf Grad Celsius über Raumtemperatur vorgewärmt wurde, wobei Sie in einer zertifizierten Abzugshaube arbeiten. Inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation nehmen Sie den Rack aus dem Paraformaldehyd und waschen die Objektträger, indem Sie den Rack 15-mal in PBS eintauchen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal, wobei Sie jedes Mal frische PBS-Lösung verwenden.

Als Nächstes tauchen Sie die Objektträger 10 Minuten lang in frisch zubereitete Azetylierungspuffer, um die unspezifische Bindung der RIBA-Sonde zu verringern. Anschließend waschen Sie die Objektträger wie zuvor, verwenden diesmal jedoch zweifach konzentrierte SSPE-Pufferlösung als Waschlösung. Dehydrieren Sie das Gewebe durch eine Ethanolreihe mit 70, 95 und 100 % Ethanol, jeweils zwei Minuten in jeder Lösung.

Anschließend trocknen Sie die Objektträger mindestens 10 bis 15 Minuten im Abzug. Nach der Synthese der RIBA-Sonde gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll berechnen Sie das erforderliche Volumen an RIBA-Sonde und Hybridisierungslösung für alle Objektträger. Erwärmen Sie die Hybridisierungsmischung der Ribo-Sonde vorab fünf Minuten lang auf 65 Grad Celsius.

Um die Ribo-Sonde zu denaturieren, pipettieren Sie 100 Mikroliter der Ribo-Sonden-Hybridisierungslösung und verteilen Sie diese über die Deckglasoberfläche. Anschließend verwenden Sie ein zweites Deckglas, um die Lösung gleichmäßig über das Gewebe und das Deckglas zu verteilen. Stellen Sie den Objektträger horizontal und aufrecht in ein Metallgestell, und sobald alle Objektträger vorbereitet sind, tauchen Sie das Gestell langsam in ein Ölbad mit 65 Grad Celsius für mindestens vier Stunden und maximal 16 Stunden ein.

Das Öl erzeugt nach der Inkubation um die Deckgläser herum eine luftdichte Abdichtung. Entfernen Sie überschüssiges Öl vom Metallgestell mit den Objektträgern. Anschließend stellen Sie das Gestell in eine Glas- oder Metallschale, die Chloroform in einer Abzugshaube enthält. Wiederholen Sie die Wäsche mit einer zweiten Schale, die frisches Chloroform enthält.

Als Nächstes tauchen Sie den Rack in eine 0,1 %ige Beta-Me-Cap-lösung in Ethanol plus zweifach konzentrierte SSPE-Lösung, um die Deckgläser zu lösen und überschüssige Hybridisierungslösung aufzulösen. Danach überführen Sie die Objektträger in eine zweite Lösung aus frischer 0,1 %iger Beta-Me-Cap-lösung in Ethanol plus zweifach konzentrierter SSPE-Lösung. Überführen Sie die unbedeckten Objektträger in einen frischen Rack in einer Wanne, die 0,1 %iges Beta-Me-Cap in Ethanol in zweifach konzentrierter SSPE enthält, und inkubieren Sie diese Lösung eine Stunde bei Raumtemperatur, um überschüssige, nicht gebundene RNA-Sonde zu entfernen.

Überführen Sie dann das Objektträgergestell in vorgewärmte SSPE-Pufferlösung (2× SSPE) mit 50 % Hauptwaschlösung bei 65 Grad Celsius, die Beta-ME (Captoethanol) zur Endkonzentration von 0,1 % enthält, und inkubieren Sie eine Stunde bei 65 Grad Celsius. Nach der Inkubation entsorgen Sie diese und alle vorherigen wässrigen Waschlösungen sowie die Deckgläser als radioaktiven Abfall. Waschen Sie anschließend die Objektträger zweimal je 30 Minuten lang in vorgewärmter SSPE-Pufferlösung (0,1× SSPE) bei 65 Grad Celsius.

Anschließend das Gewebe durch eine Ethanolreihe mit 70 %, 95 % und 100 % für jeweils zwei Minuten entwässern. Zum Schluss die Objektträger mindestens 30 Minuten in einem Abzug trocknen. Zunächst, um festzustellen, ob ein radioaktives Signal im Gewebe vorhanden ist.

Legen Sie die getrockneten Objektträger in eine Filmkassette und arbeiten Sie dabei in einem abgedunkelten Raum mit einer Sicherheitsbeleuchtung. Legen Sie einen Röntgenfilm über die Objektträger. Achten Sie darauf, dass die Objektträger der Emulsionsseite des Films zugewandt sind, und schließen Sie dann die Kassette. Belichten Sie die Objektträger je nach erwarteter Häufigkeit der Transkripte ein bis sieben Tage lang gegenüber dem Film.

Nach Abschluss der Belichtung entwickeln Sie den Röntgenfilm in Standard-Entwickler und Fixierer. Das Hybridisierungssignal erscheint als schwarze Bereiche auf dem Film, die sich aus belichteten Silberkörnern in der Emulsion ergeben, um die zelluläre Auflösung zu bestimmen und das Signal direkt im Gewebe sichtbar zu machen. Die Objektträger werden in photographische Emulsion getaucht und anschließend kontrastgefärbt.

Wenn die Objektträger mit Crestalviolett kontrastgefärbt werden sollen, müssen die Schnitte gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll entparaffiniert werden. Geben Sie zu diesem Zeitpunkt im Dunkelraum destilliertes Wasser in ein Reagenzglas. Entnehmen Sie vorsichtig die NTB-Emulsion und verdünnen Sie die Emulsion mit destilliertem Wasser im Verhältnis eins zu eins.

Nachdem die Emulsion 20 bis 30 Minuten in einem Wasserbad bei 42 Grad Celsius geschmolzen wurde, überführen Sie sie in einen Glas-Tauchbehälter in einem Wasserbad bei 42 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten. Der Stand der verdünnten Emulsion sollte nun alle Schnitte auf einem Objektträger bedecken, wenn dieser darin getaucht wird. Falls viele Objektträger vorliegen, kann zusätzliche Emulsion erforderlich sein.

Tauchen Sie die Objektträger nun in die verdünnte Emulsion in einem Wasserbad mit 42 Grad Celsius und trocknen Sie die getauchten Objektträger über Nacht in einem geschlossenen, lichtdichten Behälter im Dunkelraum oder zwei bis drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius im Ofen bei ausgeschaltetem Licht. Nach dem Trocknen bringen Sie die Objektträger in eine Objektträgerbox. Versiegeln Sie die Ränder mit schwarzer Isolierband und überziehen Sie sie anschließend mit Aluminiumfolie.

Bewahren Sie die Kästen bei vier Grad Celsius mehrere Tage bis Wochen lang auf, bis sie entwickelt werden sollen, und erwärmen Sie die Objektträger vor der Entwicklung auf Raumtemperatur. Entnehmen Sie dann im Dunkelraum den Rack mit den Objektträgern den Kästen und entwickeln Sie sie drei bis fünf Minuten lang im Entwickler Kodak D 19 bei 16 Grad Celsius. Anschließend waschen Sie die entwickelten Objektträger eine Minute lang bei Raumtemperatur mit Leitungswasser.

Anschließend die Objektträger zweimal je sechs Minuten in Fixierlösung bei 19 Grad Celsius inkubieren; während der zweiten Fixierungsinkubation können die Raumlichter eingeschaltet werden. Danach die Objektträger mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in fließendem Wasser waschen. Verwenden Sie dann eine Rasierklinge, um die Emulsion von der Rückseite des Objektträgers abzukratzen, während dieser noch nass ist.

Schließlich mit 0,3 % Kristallviolett kontrastfärben und die Objektträger gegebenenfalls gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll dehydrieren und eindeckeln. Entfernen Sie überschüssige Emulsion auf der Rückseite der Objektträger, indem Sie diese mit Wasser benetzen und mit einem Rasiermesser abkratzen. Spülen Sie die Objektträger in 80 %iger Ethanol-Lösung und wischen Sie sie ein- bis zweimal vorsichtig ab, um Rückstände und Staub zu entfernen.

Nehmen Sie Aufnahmen unter Dunkelfeld- oder Hellfeldbeleuchtung vor. Die Abkratz- und Reinigungsschritte müssen möglicherweise zwei bis drei Mal wiederholt werden, um gute Bilder ohne Staubpartikel zu erhalten, die im Dunkelfeld unter einem Stereomikroskop leicht sichtbar sind. Die folgenden Bilder zeigen Beispiele der Autoradiographie einer *in situ*-Hybridisierung von Röntgenfilmen.

Dieses Röntgenfilm-Bild zeigt einen sagittalen Gesamtkopfschnitt des Zebrafinken-Singvogels am embryonalen Tag 10, der mit einer Antisense-Ribo-Sonde für Fox P1 hybridisiert wurde. Die schwarzen belichteten Körner auf dem Film zeigen die Messenger-RNA-Expression, wie sie innerhalb des Gehirns zu sehen ist. Fox P1-Messenger-RNA ist hier angereichert im Mesopallium, Striatum und dorsalem Thalamus. Das Röntgenfilm-Bild zeigt einen Schnitt desselben Zebrafinken-Singvogels, der mit der 90-Cent-RIBA-Sonde für Cuper hybridisiert wurde.

TF zwei Co.TF zwei ist angereichert im Bereich des dorsalen Palliums und des weiter ventral gelegenen Thalamus. Die folgenden Bilder zeigen Beispiele für Autoradiographien der *in situ*-Hybridisierung von Emulsionspräparaten. Diese Dunkelfeldaufnahme, angefertigt mit einem Stereomikroskop, zeigt einen sagittalen Ganzkopfschnitt eines Zebrafinken am sechsten Tag nach dem Schlupf, der mit einer Antisense-RIBA-Sonde für Fox P eins hybridisiert wurde.

Die weißen sichtbaren Silberkörner in der Emulsion über dem Gewebe zeigen die Expression von Boten-RNA. Die rote Färbung stellt die Kreuzfarbstainierung dar. Die Maßstabsleiste entspricht einem Millimeter.

Hier zeigt das Bild einen Ausschnitt aus demselben Singsperling der Zebrafinkenart, der mit einem Antisense-Riboprobe für Coop TF zwei hybridisiert wurde. Die folgenden Bilder vergleichen die Antisense- und Sense-Färbung, die unterschiedliche Muster in der Autoradiographie auf Röntgenfilmen von Schnittpräparaten des Gehirns von Zebrafinken am embryonalen Tag 12 zeigen. Die gestrichelte Linie markiert die Kontur des gesamten Gehirns, und der Buchstabe C kennzeichnet das Kleinhirn.

Es ist ersichtlich, dass der Antisense-Strang von PAC sechs im Gehirn exprimiert wird, insbesondere in der ventrikulären Zone. Der angrenzende Schnitt, der mit dem Sense-Strang von PAC sechs hybridisiert wurde, zeigt keine Hintergrundexpression im gesamten embryonalen Kopf, jedoch eine deutliche Expression in der Pigmentepithelschicht der Netzhaut, wie bereits beim Antisense-Strang beobachtet. Die folgenden Bilder zeigen in C zwei Signale der Genexpression sowie mit Emulsion bedeckte Objektträger, die aus dem Gehirn von Zebrafinken in späten embryonalen Stadien stammen und im Hellfeld- sowie Dunkelfeldblick aufgenommen wurden.

Dieses Hellfeldbild zeigt die Expression von D one B am embryonalen Tag 10. Bei normaler Belichtung auf die Emulsion ist die als schwarz erscheinende Markierung bei dieser Vergrößerung kaum sichtbar. Dieses Bild zeigt denselben Schnitt und dieselbe Vergrößerung wie im vorherigen Bild, jedoch im Dunkelfeld, wodurch die Markierung im Striatum und Thalamus in Weiß erscheint.

Dieses Hellfeldbild zeigt die Expression von Slit drei am zwölften embryonalen Tag. Nach einer Überbelichtung der Emulsion ist die schwarze Markierung leicht zu erkennen. SC markiert die Position des Rückenmarks und CB markiert die Position des Kleinhirns.

Rostal ist nach links orientiert. Das hier gezeigte Bild stellt denselben Schnitt dar, lediglich die Betrachtungsweise wurde auf Dunkelfeld umgestellt, wodurch die Markierung im Rückenmark in Weiß erscheint, was der Hellfeldaufnahme entspricht. Die folgenden Bilder zeigen die Silberkorn-Auflösung auf zellulärer Ebene.

Hier ist die Markierung von Fox P1-Messenger-RNA im Vorderhirn des Zebrafinken dargestellt, wobei Silberkörner als schwarze Punkte über Zellen erscheinen, die mit Cresylviolett gefärbt sind. Dieses Bild zeigt einen hohen Expressionsgrad einzelner Zellen im mesoalen Bereich des adulten Zebrafinken. Dieses Bild zeigt einen geringen Expressionsgrad einzelner Zellen im angrenzenden Alium desselben Schnitts hier.

Hallo Fox. P-ein-Messenger. Die RNA-Expression über Zellen ist am embryonalen Tag 12 im Mesodarm sichtbar.

Die hier sichtbaren embryonalen Zellen sind kleiner und dichter gepackt im Vergleich zu den im vorherigen Bild gezeigten adulten Zellen. Schließlich zeigt dieses Bild eine geringe Expressionshäufigkeit über Zellen im angrenzenden Alier des gleichen Schnitts. Nach Durchführung dieses Verfahrens kann eine andere Methode wie die Immunchemie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, in welchem Zelltyp das Zielgen exprimiert wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die In-situ-Hybridisierung durchführt. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit radioaktiven Reagenzien äußerst gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie den persönlichen Schutz während dieses Verfahrens.