Ein hoher Durchsatz In situ Hybridisierung Methode zur mRNA Expression Patterns in der Fetal-Maus unteren Urogenitaltrakts Charakterisieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Muster der mRNA-Expression in sich entwickelnden urogenitalen Geweben des unteren Bereichs von fötalen Mäusen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine mit Digoxigenin markierte Ribo-Sonde aus einer PCR-amplifizierten Vorlage synthetisiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, dicke Schnittabschnitte mithilfe eines vibrierenden Mikrotoms herzustellen.

Der dritte Schritt besteht darin, eine In-situ-Hybridisierung in Abschnitten des unteren Harn- und Geschlechtsapparats durchzuführen, die sich in maßgeschneiderten Körben befinden. Die mRNAs werden mittels immunhistochemischer Detektion gebundener Ribo-Proben unter Verwendung des BM-Purple-Fällungssubstrats für alkalische Phosphatase sichtbar gemacht. Letztendlich kann die Mikroskopie die räumliche und zeitliche Lokalisation von mRNA-Transkripten mit geringer und hoher Häufigkeit im unteren Harn- und Geschlechtsapparat der fötalen Maus zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Immunhistochemie liegt darin, dass Ribo-Proben einfach herzustellen sind und so konstruiert werden können, dass sie die meisten mRNAs im gesamten Mausgenom erkennen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Muster der mRNA-Expression während der fötalen Entwicklung des urogenitalen Systems der Maus ermöglicht, kann sie auch auf andere Organsysteme, Arten und Entwicklungsstadien angewendet werden. Eine visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da das Einbetten des Gewebes in Auger schwierig zu erlernen sein kann und bereits geringfügige Abweichungen in der Ausrichtung zu inkonsistenten Ergebnissen führen können. Mindestens einen Tag vor der Gewebepräparation entfernen und verwerfen Sie die Membran aus einer 12 Millimeter durchmessenden Milli-Zellkulturplatte, während der verbleibende Ring als Form dienen wird; lassen Sie die Ringe über Nacht in einer RNase-Inhibitor-Lösung einweichen.

Am Tag des Protokolls dissezieren Sie einen mit Methanol in abgestufter Konzentration rehydrierten unteren Urogenitaltrakt einer Maus. Nach Waschungen mit PBST verwerfen Sie ungefähr zwei Drittel der Harnblase und lagern das verbleibende Gewebe des unteren Urogenitaltrakts in PBST ein. Platzieren Sie nun eine behandelte Ringform auf einem Objektträger aus Glas und füllen Sie diese mit einer 4 %igen Low-Melt-Agarose-Lösung bei 62 Grad Celsius, die etwa zwei Minuten lang abkühlen gelassen wird.

Blockieren Sie nun das Gewebe des unteren Urogenitaltrakts trocken und tauchen Sie es in die entstandene Lösung ein. Orientieren Sie das Gewebe mit einer Pinzette so, dass es mittig zwischen Ober- und Unterseite des Ringes schwebt. Inkubieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius, bis die Lösung erstarrt ist.

Bevor das Gewebe geschnitten wird, bereiten Sie eine modifizierte Wilkinson-Klinge vor, indem Sie sie mit Lösungsmitteln und anschließend mit Wasser spülen. Trennen Sie die Doppelklinge längs in zwei Einzelklingen. Stützen Sie anschließend die Wilkinson-Klinge mit einer Mikrotomklinge.

Schneiden Sie dazu zuerst die Mikrotomschneide auf die Länge der Wilkinson-Schneide zu. Verkleben Sie anschließend mithilfe eines Festbett-Klebers die Mikrotomschneide mit der Wilkinson-Schneide, wobei der Abstand zur Schneidkante etwa drei bis vier Millimeter betragen sollte. Befestigen Sie nun die verstärkte Schneide im vibrierenden Mikrotom und stellen Sie den Schneidenwinkel auf 35 Grad ein.

Bereiten Sie das Deluxe-Probenbad vor, indem Sie das Bad mit PBS füllen und es mit nassem Eis umgeben. Vor dem Montieren des im Block eingebetteten Gewebes nehmen Sie es aus der Ringform und trocknen die Unterseite ab. Anschließend kleben Sie die getrocknete Fläche mit Loctite-Kleber auf die Montagescheibe.

Legen Sie die Scheibe in den Vibratome ein und stellen Sie die Schnittdicke auf 50 Mikrometer, die Geschwindigkeit auf zwei und die Klingelamplitude auf vier ein. Übertragen Sie während des Schneidens der Gewebeschnitte jeden Schnitt mit einer stumpfen Pinzette in eine 24-Loch-Kulturplatte, die mit einem halben Milliliter eiskalter PBS-Tween-Lösung gefüllt ist. Nach dem Schneiden entfernen Sie mithilfe einer Feder-Schere den größten Teil der Aros rund um jeden Gewebeschnitt, bevor Sie mit der INI-Hybridisierung beginnen. Die Schnitte können bis zu 48 Stunden bei vier Grad Celsius in PBS-Tween, das zwei Millimolar Natriumazid enthält, gelagert werden.

Zunächst stellen Sie benutzerdefinierte Probennetze her, indem Sie den Boden eines Mikrozentrifugenröhrchens an der 100-Mikroliter-Marke abschneiden. Erhitzen Sie den Schnitt des Röhrchens in einer Flamme, bis der Kunststoff weich ist. Drücken Sie dann den weichen Kunststoff fest auf ein Maschenquadrat.

Lassen Sie es aushärten und schneiden Sie das überschüssige Netzmaterial ab. Vervollständigen Sie die Körbchen, indem Sie mit einer erhitzten Nadel der Stärke 18 zwei Löcher in jeden Tubendeckel stechen. Stellen Sie ein Tablett zur Aufnahme der Probenkörbchen her, indem Sie 24 gleichmäßig verteilte 12-Millimeter-Löcher in den Deckel einer 24-Loch-Platte bohren.

Jedes Loch sollte direkt über einer Vertiefung positioniert werden, bevor mit dem Vorheizen einer geschlossenen Hybridisierungskammer begonnen wird, die mit einem halben Zoll Leitungswasser auf 60,5 Grad Celsius gefüllt ist. Beginnen Sie die In-situ-Hybridisierung, indem Sie zwei Milliliter PBS-Tween in jede Vertiefung der 24-Loch-Kulturplatte geben. Decken Sie diese Platte mit dem vorbereiteten Deckel, der die Körbe enthält, ab.

Überführen Sie die Gewebeschnitte nun bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln in die Körbchen und inkubieren Sie die Schnitte in 6 % Wasserstoffperoxid mit PBS-Tween, gefolgt von einer Serie von Waschschritten mit PBS-Tween, einer Inkubation mit Proteinase K, einer weiteren Fixierung und weiteren Waschungen. Um die Probenvorbereitung abzuschließen, geben Sie zwei Milliliter der vorgewärmten Prähybridisierungspufferlösung in jedes Loch und inkubieren Sie die Platte im beheizten Hybridisierungskammer mindestens eine Stunde lang. Starten Sie die Hybridisierung, indem Sie 0,5 Mikrogramm markierte RIBA-Sonde zu jedem Ansatz hinzufügen.

Dann fahren Sie mit der Inkubation über Nacht in der beheizten Hybridisierungskammer fort. Am nächsten Tag waschen Sie die Gewebe mit Lösung eins, wobei schrittweise zu Lösung zwei gewechselt wird, und behandeln Sie anschließend mit RNAsen. Danach waschen Sie in Lösung drei, gefolgt von Waschungen in TBS-Tween und Gewebesperrpuffer, während die Gewebe im Gewebesperrpuffer inkubieren.

Beginnen Sie nach der Inkubationszeit eine mindestens zweistündige Inkubation des Anti-Dig-Antikörpers im Antikörperabsorptionspuffer bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Antikörperlösung bei 10.000 U/min für eine Minute. Um unlösliche Bestandteile zu entfernen, geben Sie die Senna zu zwei Millilitern Antikörperlösungspuffer hinzu.

Entfernen Sie nun das Gewebe aus der Blockierpufferlösung und inkubieren Sie es in der zubereiteten Antikörperlösung. Lagern Sie es am dritten Tag des Verfahrens über Nacht in einer Hybridisierungskammer bei vier Grad Celsius. Waschen Sie das Gewebe mehrmals in TBST mit dem Ole.

Dann mit einer Glas-Pasteurpipette die Gewebe vorsichtig in saubere Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Die Gewebe zehn Minuten lang mit einem Milliliter NTM ohne Zusatz waschen.

Danach die Lösung durch TMT mit Lava-Sole-MBM-Purpur ersetzen. Die Röhrchen im Dunkeln aufbewahren und über mehrere Tage hinweg die Farbentwicklung überwachen sowie die Lösung bei Bedarf wechseln. Nach vollständiger Farbentwicklung die Gewebe kurz mit TMT, das Lava-Sole enthält, waschen und anschließend über Nacht bei vier Grad Celsius in PBS mit Paraformaldehyd inkubieren.

Am nächsten Tag die Gewebe mit Bleiche behandeln und waschen. Die Schnitte sind nun bereit für die Bildgebung. Das Gewebe des unteren Harn- und Geschlechtsapparats wurde in Agar eingebettet, sodass die Harnröhrenmittellinie parallel zur flachen Oberfläche des Agar-Plugs lag.

Diese Orientierung ergab sagittale Schnitte. Speziell angefertigte Probenträger schützten die empfindlichen Gewebeschnitte vor Staub und Partikeln. Während des mehrtägigen in-situ-Hybridisierungsverfahrens in C zwei.

Sie verhinderten außerdem den Verlust von Schnitten. Es ist schwierig, die Hintergrundfärbung während der langen Inkubationen, die zur Detektion von mRNA mit geringer Häufigkeit erforderlich sind, einzuschränken. Die Zugabe von Natriumazid und die anschließende Filtration scheinen jedoch die Hintergrundfärbung begrenzt zu haben.

Außerdem zeigten sich keine sichtbaren Unterschiede bei der Hintergrundanfärbung, wenn die Proben über längere Zeiträume in der Farbentwicklungs-Lösung inkubiert wurden. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von sechs Tagen abgeschlossen werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um festzustellen, ob das Expressionsmuster der mRNA mit dem Expressionsmuster des Proteins korreliert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mRNA-Expressionsmuster und die sich entwickelnde untere Genitaltraktregion der Maus visualisiert.